大鼠骨髓間充質干細胞側腦室植入對SAH后CVS大鼠的影響.pdf

1、一、大鼠骨髓間充質干細胞的分離、培養(yǎng)、鑒定及神經(jīng)元條件培養(yǎng)基對其定向誘導分化
　　 二、大鼠SAH后CVS模型制備及行為學、生物學指標測定
　　 三、BrdU標記的BMSCs側腦室植入后對SAH后CVS大鼠行為學影響的研究
　　 目的：通過BMSCs側腦室植入SAH后CVS大鼠，觀察標記的BMSCs在大鼠腦內生長情況，結合行為學檢測評價BMSCs植入后效果。
　　 方法：第5代BMSCs，用5-溴脫氧尿核

2、苷（Bromodeoxyuridine，BrdU）標記2d。將標記后的細胞爬片進行免疫細胞化學染色，一抗為BrdU抗體。標記好的細胞以5×106的細胞懸液側腦室注入SAH后的大鼠。SAH大鼠以其神經(jīng)功能評分為參照，隨機分為三組：SAH組、SAH后植入DMEM組和SAH后BMSCs植入組。SAH組不植入干細胞，而DMEM組于第二次注血2d后立體定向儀下用微量注射器注入30μLDMEM培養(yǎng)基。BMSCs組在第二次注血后2d立體定位儀下注入3

3、0μL的BMSCs懸液。BMSCs組中5只大鼠于14d后進行Morris水迷宮檢測，另外5只取腦進行免疫組化染色。腦立體定位儀下大鼠側腦室穿刺取前囟定位，前囟后1.2mm，中線旁2mm處進針，接上已事先抽好BMSCs懸液或是DMEM的微量注射器，深度為4.5mm，將30μLBMSCs懸液或DMEM培養(yǎng)基緩慢注入側腦室。各組大鼠在注射后14d麻醉，固定取腦，切片，進行免疫組化染色，H2O2滅活內源性酶，加入抗原修復液，生物微波爐加熱抗原修

4、復，滴加5％BSA封閉液，一抗（小鼠抗BrdUIgG），37℃1h，生物素化二抗，37℃20min，DAB染色，脫水透明，中性樹膠封片。SAH組及DMEM組、BMSCs組1d、2d、3d、5d、7d后行神經(jīng)生物學功能評分，于14d后進行水迷宮檢測。
　　 結果：BrdU標記后BMSCs，經(jīng)免疫細胞化學染色為胞核著色，以胞核呈棕黃色者為陽性。腦立體定位儀下行側腦室穿刺，以前囟定位，能準確注入側腦室。SAH大鼠側腦室穿刺注入干細胞懸

5、液后無不良反應。腦石蠟切片DAB染色后，可見經(jīng)BrdU標記的陽性細胞胞核呈棕褐色，陽性細胞在切片內無明顯規(guī)律，散在分布于陰性細胞之間。DMEM組可見陰性細胞核仍呈藍色。將SAH組、DMEM組及BMSCs組大鼠于注射后1d、2d、3d、5d、7d進行神經(jīng)生物功能評分，無論是SAH組還是DMEM、BMSCs組可見，在各組里以1d神經(jīng)生物學功能評分普遍高于其它組（P<0.05），以后評分逐漸下降，BMSCs組大鼠在7d時與DMEM和SAH組相

6、比，神經(jīng)生物功能評分明顯減低，感覺運動功能恢復（P<0.05）。Morris水迷宮檢測BMSCs組大鼠平均逃避潛伏期時間比SAH組和DMEM組要短，有統(tǒng)計學差異，探索實驗顯示BMSCs組跨越平臺的次數(shù)多于其它兩組，差異有明顯統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　 結論：1BrdU可以用來標記BMSCs，標記后的細胞可用相應的抗體檢測。2腦立體定位儀下以前囟后1.2mm，中線旁2mm處進針，深度為4.5mm的位置能準確注入側腦室，注射

7、后大鼠未見明顯不良反應。3注入BrdU標記過的BMSCs后，取前囟后4mm的海馬組織切片免疫組化染色顯示有BrdU陽性細胞存在。4生物學功能評分可見BMSCs組在7d時評分下降，表明感覺和運動功能有一定程度的恢復。5Morris水迷宮顯示BMSCs組在學習記憶能力方面也有一定的改善。
　　 四、SAH后CVS大鼠移植BMSCs后海馬神經(jīng)元凋亡的研究目的：大鼠SAH后CVS模型基礎上植入BMSCs，大鼠感覺、運動功能有一定程度的恢

8、復，進一步觀察BMSCs植入后對大鼠腦內海馬神經(jīng)元凋亡相關蛋白Bcl-2和Bax表達的影響。
　　 方法：在第三部分大鼠腦組織切片基礎之上，取SAH組、DMEM組和BMSCs組14d前囟后4mm處大腦皮層及海馬組織石蠟切片，以兔抗鼠Bcl-2和Bax為一抗，進行免疫組織化學染色。圖像分析軟件分析陽性細胞數(shù)目比率。無菌條件下取SAH及BMSCs14d組大腦，剝出海馬，按每100mg腦組織加入1mL，裂解液，超聲裂解后低溫離心，取上

9、清，考馬斯亮蘭測定蛋白含量，蛋白變性后上樣，電泳、轉硝酸纖維素膜（NC膜），脫脂奶粉封閉，分別加入兔抗大鼠Bcl-2、Bax一抗，4℃靜置過夜。滴加辣根過氧化物酶標記二抗，免疫化學發(fā)光，X光片顯影定影。使用Hema成像分析系統(tǒng)對顯色條帶進行半定量分析，測定各組蛋白相對表達水平。
　　 結果：與SAH組相比，BMSCs組海馬可見Bcl-2陽性細胞數(shù)目增加，細胞呈黃褐色，深染；Bax陽性細胞數(shù)目減少，著色較淺。SAH組大鼠海馬可見B

10、cl-2陽性細胞數(shù)目較少，著色淺；相反Bax陽性細胞數(shù)目增加，細胞呈棕褐色較深。DMEM組可見Bax陽性細胞數(shù)目增加，而Bcl-2陽性細胞數(shù)目相對減低。Westernblot顯示，DMEM組、SAH組和BMSCs組大鼠海馬GAPDH表達三組基本相似，Bcl-2在BMSCs組比DMEM組和SAH組表達高（P<0.05）。Bax的表達在SAH組與DMEM組高于BMSCs組，相比有明顯統(tǒng)計學差異（P<0.05）。
　　 結論：1SAH

11、后CVS模型大鼠側腦室植入BMSCs后，大腦皮層和海馬內可見神經(jīng)元抑制凋亡相關基因表達增加，而促凋亡相關基因表達下降。2SAH組14d大鼠腦內促凋亡相關基因表達升高，抑制凋亡相關基因表達下降。3DMEM組大鼠腦內僅有少量的抑制凋亡相關基因表達，促凋亡相關基因表達較高。
　　 五、SAH后CVS大鼠側腦室植入BMSCs腦血管超微結構觀察與血中NOS、ET-1含量變化目的：觀察SAH后CVS大鼠側腦室植入BMSCs后血中一氧化氮合酶

12、、內皮素-1含量變化，同時透射電鏡觀察大鼠腦內血管和神經(jīng)元超微結構改變，為細胞移植治療提供理論和實驗依據(jù)。
　　 方法：實驗動物分組、SAH模型制備及BMSCs移植同前面幾部分，分為正常對照組、SAH組及BMSCs組。于移植BMSCs后1d、3d、7d進行取血，測定大鼠血中NOS和ET-1含量，具體方法同前面第二部分。同時取前囟后4mm大腦皮層腦組織約1mm×1mm×2mm大小，用2.5％戊二醛磷酸鹽緩沖液中后固定1d，備透射電

13、鏡檢查。將標本用0.1M磷酸緩沖液洗3次，質量分數(shù)為1％鋨酸固定，逐級梯度乙醇、丙酮脫水，環(huán)氧樹脂812包埋，聚合，用超薄切片機作0.5μm厚度切片，經(jīng)1％甲苯胺藍-天青Ⅱ染色，光鏡下定位后制作超薄切片，片厚約50nm，銅網(wǎng)撈片，醋酸鈾、檸檬酸鉛液染色。日立H-7500型透射電鏡觀察各組大鼠大腦皮層神經(jīng)元及微血管的超微結構，照相，記錄。組間比較采用單因素方差分析，各組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

14、>　　 結果：與對照組相比，SAH組后1d、3d、7d血中NOS含量明顯下降，而血中ET-1含量則明顯上升，其中以SAH3d組血中ET-1升高最為明顯，差異有統(tǒng)計學意義。與SAH組相比，BMSCs組可見血液中ET-1含量逐漸下降，而NOS含量上升，差異有統(tǒng)計學意義。與正常組相比，BMSCs組ET-1含量仍然較高，差異有明顯統(tǒng)計學意義（P<0.05），血中NOS含量有一定下降，與對照組相比不能說明有差異（P>0.1）。透射電鏡顯示，對照

15、組神經(jīng)元細胞核大而圓，染色質密度均勻，核仁明顯，核膜完整。大腦皮層毛細血管可見其內皮細胞內膜光滑，細胞核、細胞器、緊密連接清晰可見，內皮細胞的基質和基膜完整，層次清楚，管腔無狹窄。SAH組可見大腦皮層神經(jīng)元和微血管內皮細胞的水腫程度達到高峰，神經(jīng)元高度水腫，線粒體腫脹，可見部分凋亡、壞死神經(jīng)元。BMSCs組大腦皮層神經(jīng)元和微血管內皮細胞可見輕度水腫，血管內皮細胞的吞飲小泡略減少。微血管內皮細胞核固縮，管腔內微絨毛減少，管腔狹窄有一定緩解