牛白細胞介素2基因克隆、表達及多克隆抗體的制備.pdf

1、牛白細胞介素2主要是由輔助性T淋巴細胞產(chǎn)生的一種淋巴因子，通過免疫網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機體免疫功能，在機體免疫反應(yīng)中起著極為重要的作用。因其具有免疫增強劑、抗腫瘤和抗感染的特點是理想的免疫佐劑和免疫治療劑。但正常情況下，機體產(chǎn)生的BoIL-2的量非常有限，一定程度上限制了對BoIL-2的研究和應(yīng)用。本實驗主要應(yīng)用重組DNA和基因表達技術(shù)，通過RT-PCR方法克隆BoIL-2基因，并對其基因序列進行分析和表達，旨在為大量制備和生產(chǎn)高效價廉的BoIL-

2、2，為其生物學(xué)活性及應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。 根據(jù)Genbank發(fā)表的BoIL-2基因序列，設(shè)計了一對引物。以ConA刺激的外周血淋巴細胞(PMN)為材料，提取總RNA，應(yīng)用RT-PCR的方法，擴增BoIL-2基因序列。瓊脂糖凝膠電泳顯示目的片段約為477bp。測序結(jié)果顯示，克隆的BoIL-2基因與Genbank發(fā)表的BoIL-2基因序列同源性為98.7％，氨基酸同源性為99.4％。 將測序正確的pMD-18-T-IL-2重組

3、質(zhì)粒及pET30a(+)載體，用EcoRI及SalI進行雙酶切，分別回收后T4連接酶進行連接，轉(zhuǎn)化、提取重組質(zhì)粒。通過雙酶切及PCR鑒定陽性的重組質(zhì)粒進行序列測定后在大腸桿菌的表達，分子量約為23.49ku;表達產(chǎn)物主要分布在包涵體中。WesternBlot證實所得到的重組蛋白為BoIL-2重組蛋白。通過MTT法測定BoIL-2重組蛋白的活性，可知重組BoIL-2(rBoIL-2)對牛及山羊淋巴細胞有明顯作用，對豬淋巴細胞作用不明顯。用