土貝母皂苷、苷甲的抗癌作用研究.pdf

1、本文以中藥材土貝母為原料，采用溶劑法——柱層析法從中分離純化得到抗癌活性成分土貝母皂苷(皂苷)和土貝母苷甲(苷甲)，并重點研究了皂苷、苷甲的抗微管作用及對人低分化上皮樣鼻咽癌細胞(CNE-2Z)凋亡的影響?！　?.采用AKTATMexplorer100快速純化工藝開拓系統(tǒng)，在實驗條件下快速分離得到皂苷和苷甲，為土貝母皂苷成分分離提取工藝的簡化作了有益的探索?！　?.本文較系統(tǒng)研究了苷甲的抗微管作用，研究認為5μmol/L苷甲即可抑制

2、離體條件下豬腦微管蛋白加熱聚合，當(dāng)其濃度在5～10μmol/L時，苷甲對微管蛋白聚合的抑制作用與苷甲的濃度呈正相關(guān)?！　?.采用細胞免疫熒光法研究皂苷、苷甲對CNE-2Z細胞微管網(wǎng)絡(luò)的影響。25μmol/L的皂苷、苷甲作用CNE-2Z細胞3h后，熒光圖像顯示其結(jié)果與2.5μmol/L秋水仙堿作用細胞3h的結(jié)果相似，熒光充滿整個細胞質(zhì)區(qū)域，正常細胞所具有的毛玻璃樣微管網(wǎng)絡(luò)消失，表明皂苷、苷甲引起細胞微管解聚，2.5μmol/L紫杉醇處理

3、細胞3h后，細胞內(nèi)熒光主要呈束狀或晶核樣，提示微管蛋白聚合?！　?.采用透射電鏡觀察皂苷、苷甲對CNE-2Z細胞超微結(jié)構(gòu)的影響。正常培養(yǎng)的細胞結(jié)構(gòu)完整，微管清晰可見；25μmol/L的皂苷、苷甲作用24h后，多數(shù)細胞均不同程度受損，細胞的微絨毛減少乃至消失；微管網(wǎng)絡(luò)消失；細胞變圓；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)彎曲、折疊；線粒體受損，表現(xiàn)為線粒體腫脹或皺縮，數(shù)量減少；胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量自噬泡；細胞核界限不完整，核固縮或碎裂；細胞質(zhì)溶解，呈現(xiàn)典型的凋亡或壞死特征。

4、50μmol/L皂苷作用24h，則大多細胞壞死?！　?.蛋白免疫印跡結(jié)果證實10μmol/L皂苷、苷甲作用CNE-2Z細胞24h，細胞內(nèi)聚合的微管蛋白減少，解聚的微管蛋白相應(yīng)增加。25μmol/L皂苷、苷甲分別作用細胞1h，6h，12h和24h，細胞內(nèi)解聚的微管蛋白比例呈時間依賴上升。　　6.通過分子生物學(xué)方法進一步證實皂苷、苷甲誘導(dǎo)CNE-2Z細胞凋亡。試驗條件下皂苷及苷甲均使細胞Bcl-2蛋白表達減少，Raf-1蛋白磷酸化活化。

5、隨著藥物作用濃度升高，時間延長，Bax及磷酸化Raf-1蛋白表達增多。Raf-1蛋白因為磷酸化而活化，啟動細胞凋亡；而Bcl-2和Bax分別抑制和促進細胞凋亡?！　?.采用血清饑餓法對CNE-2Z細胞進行簡單的周期同步化處理后，用流式細胞術(shù)測定25μmol/L皂苷、苷甲作用24h后各時相的CNE-2Z細胞分布情況，結(jié)果表明實驗條件下皂苷、苷甲對CNE-2Z細胞周期影響不大?！　”狙芯康奶厣蛣?chuàng)新之處：　　1.利用制備型液相色譜簡單

6、快速地分離到到土貝母中皂苷、苷甲有效成分。土貝母直接入藥時有效成分不明確，劑量不確定，毒副作用大。苷甲的抗腫瘤作用強，毒副作用小，且得率高(1.9％)，水溶性和穩(wěn)定性都較好。從增加得率，簡化工藝和降低成本的角度考慮，皂苷和苷甲應(yīng)該首先開發(fā)利用。　　2.在我國，鼻咽癌是嚴重威脅人們健康的十大惡性腫瘤之一。臨床上鼻咽癌以放療為首選，目前尚無低毒高效的化療藥物。皂苷及苷甲對人低分化鼻咽癌CNE-2Z細胞株表現(xiàn)出明顯的細胞毒作用，誘導(dǎo)細胞凋亡

7、，且前期的研究工作已證實皂苷、苷甲達到有效劑量時對人體無明顯毒副作用，皂苷、苷甲是具有潛力的鼻咽癌化療藥物。這是本文研究中最重要的創(chuàng)新之處?！　?.腫瘤細胞失去了正常細胞的控制機制，癌組織中的細胞更傾向處于分裂期，而微管轉(zhuǎn)變?yōu)榧忓N體是細胞分裂中的一個重要事件。正常細胞的骨架完整，修復(fù)快，藥物不易對其造成損傷。腫瘤細胞骨架不完整，組裝程度差，藥物作用后不能及時有效地修復(fù)，導(dǎo)致細胞增殖被抑制，因而近年來，抗微管藥物的研究開發(fā)倍受矚目。本研