發(fā)夾狀RNA抑制ATO耐藥的白血病K562-AS2細(xì)胞MRP1基因表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、[目的]: 探討發(fā)夾狀RNA（shRNA）通過轉(zhuǎn)染ATO耐藥的白血病細(xì)胞株K562/AS2對(duì)MRP1基因表達(dá)的抑制作用。 [方法]: 本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)包括兩個(gè)部分：第一部分，設(shè)計(jì)并合成3條針對(duì)MRP1基因的shRNA序列，在脂質(zhì)體的介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染K562/AS2細(xì)胞，用熒光實(shí)時(shí)定量PCR分析MRP1 mRNA的表達(dá)水平，流式細(xì)胞儀檢測(cè)MRP1蛋白表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)柔紅霉素累積量；第二部分，根據(jù)第一部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果，篩選出來其中一條對(duì)

2、MRP1基因抑制效果最佳的shRNA序列，將其構(gòu)建到質(zhì)粒表達(dá)載體中，經(jīng)酶切鑒定分析和測(cè)序，分析MRP1干擾質(zhì)粒是否構(gòu)建成功。 [結(jié)果]: 第一部分：用帶熒光標(biāo)記的非特異性shRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)得轉(zhuǎn)染效率為（76.17±1.57）%；經(jīng)MRP1-shRNA作用24h后，K562/AS2細(xì)胞株中MRP1 mRNA和蛋白表達(dá)水平分別最大下調(diào)幅度為（79.1±0.07）%和（62.48±0.86）%（P<0.05）

3、，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)柔紅霉素累積量顯著增加（P<0.05），其中MRP1-shRNA b干擾序列對(duì)MRP1基因表達(dá)抑制效果最為明顯。 第二部分：將MRP1-shRNA b干擾序列構(gòu)建到質(zhì)粒pGenesil-1.1上，經(jīng)酶切鑒定及測(cè)序分析，質(zhì)粒pGenesil-1.1-MRP1-shRNA b符合設(shè)計(jì)要求，MRP1基因干擾質(zhì)粒構(gòu)建成功。此質(zhì)粒同時(shí)具有G418抗性基因和卡那霉素抗性基因以及EGFP報(bào)告基因。 [結(jié)論]： M