幽門螺桿菌對原代培養(yǎng)人胃粘膜細胞胃蛋白酶原蛋白表達的影響.pdf

1、幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，H.pylori)是慢性胃炎和消化性潰瘍的主要病因，并且與胃癌的發(fā)生關(guān)系密切[1—3]，但是H.pylorf的致病機制尚不清楚。胃蛋白酶原(pepsinogen，PG)是胃粘膜特異性功能酶—胃蛋白酶的前體，主要來源于胃體底腺的主細胞[4]，可分為胃蛋白酶原A(pepsinogen A，PGA)和胃蛋白酶原C(pepsinogen C，PGC)兩個生物學(xué)特性和免疫學(xué)特性不同的亞型[5]。

2、胃粘膜分泌的PG99％進入胃腔，1％進入血循環(huán)。血清PG水平可反映不同部位胃粘膜的形態(tài)和功能[5]。關(guān)于H．pylori與血清PG關(guān)系的研究目前集中于體內(nèi)研究[6—10]，這些研究結(jié)果可能受到H．pylori定植部位、PG亞型來源細胞分布差異、免疫反應(yīng)以及更加復(fù)雜的機體調(diào)控系統(tǒng)的影響。那么H．pylori對體外培養(yǎng)的人胃粘膜細胞PG蛋白表達的影響究竟如何？未見文獻報道。PGC基因在第7—8外顯子間的內(nèi)含子序列存在100bp的插入—缺失片

3、段長度多態(tài)，研究表明PGC基因多態(tài)與胃潰瘍、胃癌有關(guān)[10，11]，并與H．pylori在這些疾病的發(fā)生上具有交互作用[12]，但其確切機制尚不清楚。那么H．pylori對不同PGC基因多態(tài)型人胃粘膜細胞PG蛋白表達的影響如何？目前尚不清楚。 體外實驗中應(yīng)用的細胞大多是永生化的細胞系[13—16]，是因為其具有易獲取、培養(yǎng)省時省力、可以無限傳代等優(yōu)點，但是細胞系長時間的培養(yǎng)已經(jīng)很大程度地改變了其生物學(xué)特性[17]，這一點是細胞系

4、作為研究模型以來一直存在的困擾性問題。原代培養(yǎng)細胞彌補了細胞系的不足，由于其剛離體，生物學(xué)特性未發(fā)生很大變化，仍具有二倍體遺傳物性，最接近和反映體內(nèi)生長特性[18]。胃粘膜細胞原代培養(yǎng)是近三十年來尤其是上世紀(jì)八九十年代由于基礎(chǔ)研究和臨床治療的需要以及細胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展而發(fā)展起來的，其來源涉及鼠、兔、犬、人等多個種屬[19—22]。通過對原代培養(yǎng)胃粘膜上皮細胞的評價，發(fā)現(xiàn)其體外功能與體內(nèi)胃上皮細胞有很多相似之處[23—25]。H．pylo

5、ri是胃粘膜的損傷因子，是胃粘膜病變的始動因素，在細胞水平上研究H．pylori在胃疾病發(fā)生機制中的作用，前提是能夠獲得與人體胃粘膜損傷十分相近的H．pylori誘導(dǎo)損傷模型，但是目前還沒有這樣理想的實驗?zāi)Ｐ汀?本研究擬通過H．pylori與原代培養(yǎng)的人胃粘膜細胞共培養(yǎng)觀察H．pylori對胃粘膜細胞的損傷作用，建立H．pylori誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)人胃粘膜細胞損傷模型，初步探討H．pylori對原代培養(yǎng)的人胃粘膜細胞及不同PGC基

6、因多態(tài)型人胃粘膜細胞PG蛋白表達的影響，以期為研究H．pylori損傷胃粘膜細胞及細胞抗H．pylori損傷的機制提供實驗依據(jù)。 目的：建立H．pylori誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)人胃粘膜細胞損傷模型；明確H．pylori對原代培養(yǎng)的人胃粘膜細胞PG蛋白表達的影響；明確H．pylori對不同PGC基因多態(tài)型人胃粘膜細胞PG蛋白表達的影響。 方法：本研究采用腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基進行H．pylori復(fù)蘇培養(yǎng)；采用原代細胞培養(yǎng)技術(shù)進行人胃

7、粘膜細胞的培養(yǎng)；采用細菌與細胞共培養(yǎng)方法，通過倒置顯微鏡觀察細胞損傷的形態(tài)學(xué)改變，通過乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)試劑盒檢測細胞外LDH活力；采用序列特異性引物—聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法檢測PGC基因多態(tài)型，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme—linked immunosorbent assay，ELISA)方法檢測細胞培養(yǎng)上清中PG蛋白含量，計算加菌前后PG蛋白表達變化率=(加菌后PG蛋白表達量—力

8、口菌前PG蛋白表達量)/加菌前PG蛋白表達量。 結(jié)果：1.H．pylori誘導(dǎo)原代培養(yǎng)人胃粘膜細胞損傷模型的建立。正常胃粘膜細胞的原代培養(yǎng)：胃粘膜細胞接種第2天細胞呈團簇狀生長，團簇越多越密集，細胞增殖越快、數(shù)量越多；第3天細胞增殖迅速，以細胞簇為中心向外周生長，與附近的細胞群相連成片：第4天細胞鋪滿皿底約70％，細胞生長狀態(tài)良好，單層貼壁生長，呈菱形或多邊形，核大呈卵圓形。H．pylori誘導(dǎo)原代培養(yǎng)人胃粘膜細胞損傷作用的觀察

9、：H．pylori與胃粘膜細胞以100：1的比例共培養(yǎng)6小時造成了細胞的損傷：細胞間隙擴大，連接松弛，細胞表面腫脹、不規(guī)則，細胞輪廓變模糊，細胞周圍碎片增多，細胞膜、核膜變粗糙，可見空泡變性，細胞形態(tài)發(fā)生損傷改變。LDH活力測定結(jié)果顯示6'h LDH活力遠高于3'h和對照組，而與9'h基本相同。2.H．pylori對原代培養(yǎng)人胃粘膜細胞PG蛋白表達的影響。加菌組胃粘膜細胞PGA蛋白表達(247.0±104.5 ug/IL)高于對照組(2

10、39.7±107.8 ug/IL，P=0.90)，PGC蛋白表達(43.6±53.3 ug/IL)高于對照組(31.2±23.6 ug/IL，P=0.56)。各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。3.H．pylori對不同PGC基因多態(tài)型人胃粘膜細胞PG蛋白表達影響。攜帶PGC等位基因310的原代培養(yǎng)胃粘膜細胞加菌前后PGA蛋白表達變化率(0.20±0.21)高于其他型(-0.01±0.07，P=0.11)，PGC蛋白表達變化率(0.36±0.22)