幽門螺桿菌對原代培養(yǎng)人胃粘膜細胞胃蛋白酶原蛋白表達的影響.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,H.pylori)是慢性胃炎和消化性潰瘍的主要病因,并且與胃癌的發(fā)生關(guān)系密切[1—3],但是H.pylorf的致病機制尚不清楚。胃蛋白酶原(pepsinogen,PG)是胃粘膜特異性功能酶—胃蛋白酶的前體,主要來源于胃體底腺的主細胞[4],可分為胃蛋白酶原A(pepsinogen A,PGA)和胃蛋白酶原C(pepsinogen C,PGC)兩個生物學(xué)特性和免疫學(xué)特性不同的亞型[5]。

2、胃粘膜分泌的PG99%進入胃腔,1%進入血循環(huán)。血清PG水平可反映不同部位胃粘膜的形態(tài)和功能[5]。關(guān)于H.pylori與血清PG關(guān)系的研究目前集中于體內(nèi)研究[6—10],這些研究結(jié)果可能受到H.pylori定植部位、PG亞型來源細胞分布差異、免疫反應(yīng)以及更加復(fù)雜的機體調(diào)控系統(tǒng)的影響。那么H.pylori對體外培養(yǎng)的人胃粘膜細胞PG蛋白表達的影響究竟如何?未見文獻報道。PGC基因在第7—8外顯子間的內(nèi)含子序列存在100bp的插入—缺失片

3、段長度多態(tài),研究表明PGC基因多態(tài)與胃潰瘍、胃癌有關(guān)[10,11],并與H.pylori在這些疾病的發(fā)生上具有交互作用[12],但其確切機制尚不清楚。那么H.pylori對不同PGC基因多態(tài)型人胃粘膜細胞PG蛋白表達的影響如何?目前尚不清楚。 體外實驗中應(yīng)用的細胞大多是永生化的細胞系[13—16],是因為其具有易獲取、培養(yǎng)省時省力、可以無限傳代等優(yōu)點,但是細胞系長時間的培養(yǎng)已經(jīng)很大程度地改變了其生物學(xué)特性[17],這一點是細胞系

4、作為研究模型以來一直存在的困擾性問題。原代培養(yǎng)細胞彌補了細胞系的不足,由于其剛離體,生物學(xué)特性未發(fā)生很大變化,仍具有二倍體遺傳物性,最接近和反映體內(nèi)生長特性[18]。胃粘膜細胞原代培養(yǎng)是近三十年來尤其是上世紀(jì)八九十年代由于基礎(chǔ)研究和臨床治療的需要以及細胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展而發(fā)展起來的,其來源涉及鼠、兔、犬、人等多個種屬[19—22]。通過對原代培養(yǎng)胃粘膜上皮細胞的評價,發(fā)現(xiàn)其體外功能與體內(nèi)胃上皮細胞有很多相似之處[23—25]。H.pylo

5、ri是胃粘膜的損傷因子,是胃粘膜病變的始動因素,在細胞水平上研究H.pylori在胃疾病發(fā)生機制中的作用,前提是能夠獲得與人體胃粘膜損傷十分相近的H.pylori誘導(dǎo)損傷模型,但是目前還沒有這樣理想的實驗?zāi)P汀?本研究擬通過H.pylori與原代培養(yǎng)的人胃粘膜細胞共培養(yǎng)觀察H.pylori對胃粘膜細胞的損傷作用,建立H.pylori誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)人胃粘膜細胞損傷模型,初步探討H.pylori對原代培養(yǎng)的人胃粘膜細胞及不同PGC基

6、因多態(tài)型人胃粘膜細胞PG蛋白表達的影響,以期為研究H.pylori損傷胃粘膜細胞及細胞抗H.pylori損傷的機制提供實驗依據(jù)。 目的:建立H.pylori誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)人胃粘膜細胞損傷模型;明確H.pylori對原代培養(yǎng)的人胃粘膜細胞PG蛋白表達的影響;明確H.pylori對不同PGC基因多態(tài)型人胃粘膜細胞PG蛋白表達的影響。 方法:本研究采用腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基進行H.pylori復(fù)蘇培養(yǎng);采用原代細胞培養(yǎng)技術(shù)進行人胃

7、粘膜細胞的培養(yǎng);采用細菌與細胞共培養(yǎng)方法,通過倒置顯微鏡觀察細胞損傷的形態(tài)學(xué)改變,通過乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase,LDH)試劑盒檢測細胞外LDH活力;采用序列特異性引物—聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法檢測PGC基因多態(tài)型,采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme—linked immunosorbent assay,ELISA)方法檢測細胞培養(yǎng)上清中PG蛋白含量,計算加菌前后PG蛋白表達變化率=(加菌后PG蛋白表達量—力

8、口菌前PG蛋白表達量)/加菌前PG蛋白表達量。 結(jié)果:1.H.pylori誘導(dǎo)原代培養(yǎng)人胃粘膜細胞損傷模型的建立。正常胃粘膜細胞的原代培養(yǎng):胃粘膜細胞接種第2天細胞呈團簇狀生長,團簇越多越密集,細胞增殖越快、數(shù)量越多;第3天細胞增殖迅速,以細胞簇為中心向外周生長,與附近的細胞群相連成片:第4天細胞鋪滿皿底約70%,細胞生長狀態(tài)良好,單層貼壁生長,呈菱形或多邊形,核大呈卵圓形。H.pylori誘導(dǎo)原代培養(yǎng)人胃粘膜細胞損傷作用的觀察

9、:H.pylori與胃粘膜細胞以100:1的比例共培養(yǎng)6小時造成了細胞的損傷:細胞間隙擴大,連接松弛,細胞表面腫脹、不規(guī)則,細胞輪廓變模糊,細胞周圍碎片增多,細胞膜、核膜變粗糙,可見空泡變性,細胞形態(tài)發(fā)生損傷改變。LDH活力測定結(jié)果顯示6'h LDH活力遠高于3'h和對照組,而與9'h基本相同。2.H.pylori對原代培養(yǎng)人胃粘膜細胞PG蛋白表達的影響。加菌組胃粘膜細胞PGA蛋白表達(247.0±104.5 ug/IL)高于對照組(2

10、39.7±107.8 ug/IL,P=0.90),PGC蛋白表達(43.6±53.3 ug/IL)高于對照組(31.2±23.6 ug/IL,P=0.56)。各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。3.H.pylori對不同PGC基因多態(tài)型人胃粘膜細胞PG蛋白表達影響。攜帶PGC等位基因310的原代培養(yǎng)胃粘膜細胞加菌前后PGA蛋白表達變化率(0.20±0.21)高于其他型(-0.01±0.07,P=0.11),PGC蛋白表達變化率(0.36±0.22)

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