針對(duì)HBV S基因的反義鎖核苷酸體外抑制乙型肝炎病毒表達(dá)的研究.pdf

1、背景與目的：乙型肝炎病毒感染是引起急性、慢性乙型肝炎的主要原因，并與肝硬化、肝癌的發(fā)生發(fā)展有著密切關(guān)系，嚴(yán)重威脅著人類健康。目前臨床上使用的藥物專一性不高，易引起乙肝病毒變異等缺點(diǎn)，對(duì)乙肝的療效不理想。隨著分子生物學(xué)的蓬勃發(fā)展，從基因水平上探索一條治療乙肝的新途徑具有重大意義。鎖核苷酸(Lockednucleicacid，LNA)是近幾年發(fā)展起來的一種強(qiáng)有力的新型核酸替代物，本課題旨在探討針對(duì)HBVS基因翻譯起始區(qū)的反義鎖核苷酸片斷體外

2、抑制乙型肝炎病毒表達(dá)的作用，評(píng)價(jià)鎖核酸抗HBV基因治療的可行性。 方法：以乙型肝炎病毒全基因組轉(zhuǎn)染的人肝癌細(xì)胞系HepG22.2.15(2.2.15)為實(shí)驗(yàn)對(duì)象： 1.2.2.15細(xì)胞鑒定：分別用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、PCR和免疫細(xì)胞化學(xué)方法對(duì)2.2.15細(xì)胞功能活性及HBV抗原亞型進(jìn)行鑒定。 2.ASON的設(shè)計(jì)：設(shè)計(jì)并合成互補(bǔ)于HBVmRNAS基因翻譯起始位點(diǎn)(155～165nt)的11聚反義寡脫氧核苷

3、酸(ASON)，分別進(jìn)行LNA修飾(序列Ⅰ)、磷酸硫代化修飾(序列Ⅲ)和未修飾(序列Ⅱ)，同時(shí)設(shè)計(jì)合成與HBV基因的無關(guān)序列(序列Ⅳ)為對(duì)照。 3.確定給藥劑量：以2.2.15細(xì)胞接種96孔板，培養(yǎng)24h后，分別加入不同濃度(1、5、10μM)的序列Ⅰ和Ⅳ，設(shè)不含藥物的細(xì)胞為對(duì)照，72h后，ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的含量，選擇最佳藥物濃度。 4.抗原抑制率檢測(cè)：序列Ⅰ～Ⅳ以10μM一

4、次性作用于2.2.15細(xì)胞，每隔24h收集細(xì)胞上清液，連續(xù)6d，用ELISA法動(dòng)態(tài)檢測(cè)上清液中HBsAg含量變化，觀察比較不同修飾方式的ASON對(duì)HBsAg抑制的效果。 5.基因水平檢測(cè)：序列Ⅰ、序列Ⅲ以10μM作用于2.2.15細(xì)胞，設(shè)不加藥物的細(xì)胞為對(duì)照，72h后，提取細(xì)胞上清及細(xì)胞內(nèi)的HBVDNA，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(FQ-PCR)法進(jìn)行定量分析。 6.毒性檢測(cè)：四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)(MTT法)檢測(cè)LNA對(duì)細(xì)

5、胞代謝的影響，活細(xì)胞計(jì)數(shù)(臺(tái)盼蘭染色)、細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察等了解LNA對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的毒性作用。 結(jié)果：1.HepG22.2.15細(xì)胞能持續(xù)分泌表達(dá)HBsAg；PCR擴(kuò)增表明細(xì)胞培養(yǎng)上清液中含有HBVDNA，2.2.15細(xì)胞整合的HBV基因?yàn)閍yw亞型；免疫細(xì)胞化學(xué)染色HBsAg呈陽性。 2.序列Ⅰ和序列Ⅳ作用細(xì)胞72h后，以10μM的序列Ⅰ即LNA對(duì)HBsAg的抑制作用最佳(P＜0.01)，抑制率為47.21％。序列Ⅳ無明顯抑

6、制作用。 3.針對(duì)HBVS區(qū)的ASON均可不同程度抑制2.2.15細(xì)胞分泌HBsAg(P＜0.005)。作用第三天(3d)出現(xiàn)抑制高峰，此后隨時(shí)間延長作用減弱。序列Ⅰ第3d抑制率可達(dá)51.19％，抑制效果比序列Ⅱ、Ⅲ強(qiáng)。序列Ⅳ對(duì)HBV抗原表達(dá)的抑制率最高為8.87％，無明顯時(shí)效關(guān)系。 4.FQ-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示細(xì)胞及培養(yǎng)上清中HBVDNA均為陽性。序列Ⅰ、序列Ⅲ均能有效地抑制HBVDNA的合成。與對(duì)照組相比，差異有明顯

7、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。組間兩兩比較差異有顯著意義(P＜0.05)，提示LNA抗病毒作用優(yōu)于反義硫代寡核苷酸。 5.LNA對(duì)2.2.15細(xì)胞代謝活性的影響：LNA各濃度組與對(duì)照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。LNA在20μM濃度范圍對(duì)宿主細(xì)胞無毒性。 結(jié)論：1.HepG22.2.15具有良好的HBV表達(dá)活性，可作為抗HBV藥物篩選的研究模型。 2.針對(duì)HBVS基因翻譯起始區(qū)的反義鎖核苷酸片斷體外能有效