HSF1在子宮內(nèi)膜癌細胞株中拮抗氧化損傷作用的體外實驗研究.pdf

1、【背景】
　　子宮內(nèi)膜癌是對女性健康產(chǎn)生極大威脅的惡性腫瘤,近年來其發(fā)病率和病死率都呈現(xiàn)上升趨勢,儼然已經(jīng)成為一個嚴重的公共衛(wèi)生難題,它作為嚴重危害女性健康的疾病已受到全世界的廣泛關注。美國2012年有47130名女性被診斷患有子宮內(nèi)膜癌并且有8010例因其死亡。在2004-2005年衛(wèi)生部惡性腫瘤回顧調(diào)查中,顯示子宮內(nèi)膜癌死亡率以約2.71/10萬高居女性惡性腫瘤死亡率第十位(2012中國衛(wèi)生統(tǒng)計年鑒)。盡管多數(shù)子宮內(nèi)膜癌病例是

2、早期,但由于晚期以及低分化子宮內(nèi)膜癌的預后極差,其5年生存率并不令人滿意,因此子宮內(nèi)膜癌的早期發(fā)現(xiàn)和及時治療顯得至關重要。
　　熱休克因子1(Heat shock factor1,HSF1)是調(diào)節(jié)細胞熱休克蛋白(HSPs)表達的主要轉(zhuǎn)錄因子,熱休克反應被激活后HSF1能迅速改變HSP基因位點并增加它們的表達,熱休克蛋白可以幫助錯誤折疊的多肽重新折疊并抑制蛋白聚合。這有利于細胞抑制蛋白應激毒性和保持蛋白質(zhì)體內(nèi)平衡,使生物具有可感應應

3、力的分子機制來檢測和中和蛋白損傷。HSF1已經(jīng)通過細胞檢測、器官模型檢測、進而包括酵母、線蟲、嚙齒目動物等生物水平的分析全面描述了它的功能。
　　盡管HSF1幫助細胞和有機體對抗嚴重有害刺激的作用已被廣泛研究并取得了一些研究結(jié)果,但仍然有許多問題亟待探討:HSF1對下游因子調(diào)控的功能是否參與腫瘤發(fā)生發(fā)展?HSF1對細胞的保護作用在其參與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展、氧化應激、細胞周期調(diào)控及凋亡等多種關鍵的細胞反應中發(fā)揮著怎樣的作用?干預HS

4、F1后對這些細胞反應又有何影響?
　　為了驗證HSF1在子宮內(nèi)膜癌中的表達及其作用,本實驗以不同濃度的過氧化氫分別作用于子宮內(nèi)膜癌細胞株,觀察細胞的生存情況、HSF1的表達變化情況以及細胞受損傷狀況、抗氧化系統(tǒng)和線粒體功能改變情況,探討HSF1對子宮內(nèi)膜癌細胞株抗凋亡能力的影響及其作用機制,從而為以HSF1為子宮內(nèi)膜癌的治療靶點提供新的思路。
　　【研究目的】
　　1.探討HSF1在子宮內(nèi)膜癌細胞株的表達及其作用

5、>　　2.探討HSF1對子宮內(nèi)膜癌細胞株抗凋亡能力的影響及其作用機制
　　【研究方法】
　　1.應用實時熒光定量PCR、Western blot技術檢測子宮內(nèi)膜癌細胞中HSF1的表達水平。
　　2.應用實時熒光定量PCR的方法檢測子宮內(nèi)膜癌細胞受到不同濃度過氧化氫刺激后HSF1的表達變化。
　　3.MTT法檢測細胞受到不同濃度過氧化氫刺激后的受抑制情況。
　　4.應用RNAi技術下調(diào)HSF1在子宮內(nèi)膜癌細胞

6、中的表達,實時熒光定量PCR、Western blot技術檢測下調(diào)后HSF1表達水平的變化。
　　5.MTT法檢測下調(diào)HSF1后,各組細胞受到過氧化氫刺激時的受抑制情況。
　　6.Annexin V-PI雙染色法檢測下調(diào)HSF1前后,各組細胞的凋亡情況。
　　7.使用流式細胞儀檢測下調(diào)HSF1前后,各組細胞的周期變化。
　　8.使用酶標儀檢測下調(diào)HSF1前后,各組細胞丙二醛含量、過氧化氫酶活性、谷胱甘肽含量、總抗

7、氧化能力以及ATP生成情況。
　　9.使用流式細胞儀檢測下調(diào)HSF1前后,各組細胞內(nèi)活性氧含量。
　　【實驗結(jié)果】
　　1.在Ishikawa細胞中HSF1的mRNA表達水平最高,HEC-1-B其次,RL95-2最低。
　　2.在Ishikawa細胞中HSF1的蛋白表達水平最高,HEC-1-B其次,RL95-2最低。Ishikawa細胞當受到300μmol/L過氧化氫溶液刺激時HSF1表達出現(xiàn)了明顯的上調(diào),刺激濃

8、度為500μmol/L時HSF1表達繼續(xù)增高,而在濃度到達700μmol/L時細胞內(nèi)HSF1的表達卻較500μmol/L略有降低,組間差異具有統(tǒng)計學意義;HEC-1B細胞在受到300μmol/L過氧化氫刺激時HSF1表達出現(xiàn)明顯增高,而當刺激濃度為500μmol/L時HSF1的表達出現(xiàn)降低,以700μmol/L濃度刺激時甚至低于基水平,組間差異具有統(tǒng)計學意義;RL95-2細胞在50μmol/L低濃度過氧化氫刺激時HSF1表達即出現(xiàn)明顯上

9、升,當濃度300μmol/L時HSF1表達與低濃度相比已有所降低,當大于等于500μmol/L過氧化氫刺激時HSF1則出現(xiàn)了低于基水平的表達,組間差異具有統(tǒng)計學意義。
　　3.Ishikawa細胞和HEC-1-B細胞分別在受到濃度為700μmol/L和500μmol/L的H2O2刺激后,細胞抑制率顯著增高,具有統(tǒng)計學意義;而RL95-2細胞在受到300μmol/L的H2O2刺激后,細胞抑制率即出現(xiàn)具有統(tǒng)計學意義的明顯改變。

10、　　4.Ishikawa細胞轉(zhuǎn)染siRNA后HSF1的mRNA表達水平明顯降低,與空白組和陰性對照組存在顯著性差異(P<0.05),而陰性對照組與空白組無明顯組間差異(P>0.05)。
　　5.Ishikawa細胞轉(zhuǎn)染siRNA后HSF1的蛋白表達水平明顯降低,與空白組和陰性對照組存在顯著性差異(P<0.05),而陰性對照組與空白組無明顯組間差異(P>0.05)。
　　6.MTT結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染組Ishikawa細胞在受到H2O

11、2溶液刺激后細胞抑制率顯著增高且具有統(tǒng)計學意義。
　　7.轉(zhuǎn)染siRNA后的Ishikawa細胞與空白對照組相比,在受到H2O2溶液刺激時G2+S期比例減少且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　8.轉(zhuǎn)染siRNA后的Ishikawa細胞在受到H2O2溶液刺激時,與對照組相比細胞內(nèi)丙二醛含量明顯上升且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　9.正常狀態(tài)與應激狀態(tài)下的Ishikawa細胞與對照組相比過氧化氫酶活性均

12、有所減弱且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　10.Ishikawa細胞與對照組相比總谷胱甘肽含量減少且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　11.轉(zhuǎn)染組Ishikawa細胞在受到H2O2溶液刺激時,與對照組相比總抗氧化能力減弱且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　12.轉(zhuǎn)染組Ishikawa細胞在受到H2O2溶液刺激時,與對照組相比ATP水平降低且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　13.

13、轉(zhuǎn)染siRNA后的Ishikawa細胞與對照組相比,在受到H2O2溶液刺激時活性氧含量明顯增高且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　【結(jié)論】
　　1.MTT結(jié)果與三株細胞內(nèi)HSF1基水平測定的結(jié)果呈現(xiàn)相關性,HSF1基水平最高的Ishikawa細胞抑制率>50％時的刺激濃度最高,為700μmol/L;HSF1基水平最低的RL95-2細胞出現(xiàn)抑制率>50%時的刺激濃度最低,為300μmol/L;而HSF1基水平介于兩者之

14、間的HEC-1-B細胞出現(xiàn)抑制率>50%時也處于500μmol/L的中間濃度。這提示HSF1的表達可能與腫瘤應激能力相關,促進子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生。
　　2.下調(diào)HSF1在子宮內(nèi)膜癌細胞中的表達后,一系列的檢測顯示HSF1與子宮內(nèi)膜癌細胞的抗凋亡能力相關,HSF1可能是一種子宮內(nèi)膜腫瘤促進因子,它被激活時增加了子宮內(nèi)膜癌細胞抗性,從而促進了子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展。HSF1也許是一個較好的候選標志物,有可能作為可利用的腫瘤病程干預潛在靶點。