MCPIP1對SMC表型的調(diào)節(jié)及其與動脈粥樣硬化的相關性研究.pdf

1、第一章:MCPIP1在動脈粥樣硬化小鼠主動脈的表達及細胞定位
　　目的:單核細胞趨化蛋白-1誘導蛋白是新近發(fā)現(xiàn)的一類CCCH型鋅指家族分子。大量研究表明其在炎癥反應、免疫穩(wěn)態(tài)、細胞分化、自噬和凋亡等諸多方面發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。動脈粥樣硬化是一種慢性炎癥性疾病，但目前對MCPIP1與動脈粥樣硬化之間的關系尚不十分了解。因此本研究的主要目的是觀察MCPIP1在動脈粥樣硬化小鼠主動脈的表達水平及細胞定位。
　　方法:采用高膽固醇飲

2、食喂養(yǎng)8周齡apoE-/-小鼠，建立小鼠動脈粥樣硬化模型。分別進行以下實驗:(1)檢測小鼠血清血脂水平;(2)通過大體觀、蘇丹Ⅲ和HE染色，觀察小鼠主動脈斑塊形成情況;(3)通過酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測小鼠血清MCP1水平;(4)采用Western Blot檢測小鼠胸主動脈MCPIP1蛋白表達;(5)通過激光共聚焦顯微鏡觀察MCPIP1在小鼠胸主動脈的細胞定位。
　　結果:血清血脂水平檢測發(fā)現(xiàn)，與C57BL/6小鼠相比，高

3、脂喂養(yǎng)apoE-/-小鼠血清總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平明顯較高(P＜0.05)，而高密度脂蛋白(HDL-C)水平明顯較低(P＜0.05)。通過大體觀、蘇丹Ⅲ和HE染色發(fā)現(xiàn)，與C57BL/6小鼠相比，高脂喂養(yǎng)apoE-/-小鼠主動脈粥樣斑塊面積明顯較大，有顯著性差異(P＜0.05);酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測發(fā)現(xiàn)，與C57BL/6小鼠相比，高脂喂養(yǎng)apoE-/-小鼠血清MCP1水平明顯較高，有顯著性差異(

4、P＜0.05); Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)，與C57BL/6小鼠相比，高脂喂養(yǎng)apoE-/-小鼠胸主動脈MCPIP1蛋白表達顯著下調(diào)，有顯著性差異(P＜0.05);免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)小鼠主動脈血管平滑肌細胞和內(nèi)皮細胞均有MCPIP1表達，但是其在血管平滑肌細胞中表達更為顯著。
　　結論:C57BL/6小鼠和動脈粥樣硬化小鼠胸主動脈均表達MCPIP1蛋白，但動脈粥樣硬化小鼠胸主動脈MCPIP1的蛋白表達較同齡野生小鼠顯著下降。

5、小鼠主動脈血管平滑肌細胞和內(nèi)皮細胞均有MCPIP1表達，但是其主要定位于動脈壁的平滑肌細胞中。
　　第二章: MCPIP1對血管平滑肌細胞表型標志物表達的影響及機制探討
　　目的:我們前期在體研究已證實動脈粥樣硬化小鼠胸主動MCPIP1蛋白表達較同齡野生小鼠顯著下降，且小鼠主動脈的MCPIP1主要定位于血管平滑肌細胞。目前認為體外培養(yǎng)的VSMC主要表現(xiàn)為分化程度較低的合成型VSMC，我們初步研究發(fā)現(xiàn)其僅表達極少量的MCPIP

6、1蛋白。已知血管平滑肌細胞表型轉化與動脈粥樣硬化密切相關，由此，我們推測MCPIP1可能通過調(diào)節(jié)VSMC表型，影響動脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展。因此本研究的主要目的為體外觀察MCPIP1對血管平滑肌細胞表型標志物表達的影響，并進一步探討其可能機制。
　　方法:利用免疫熒光對大鼠胸主動脈血管平滑肌細胞進行鑒定。用不同濃度的MCP1(0、50、100 ng/ml)干預人和大鼠平滑肌細胞24小時后，用Western Blot和Real ti

7、me qPCR分別檢測細胞內(nèi)MCPIP1、myocardin及其下游靶基因SM-α-actin、SM22蛋白及mRNA的表達水平。用攜帶MCPIP1的重組腺病毒轉染hSMCs48h，檢測細胞內(nèi)MCPIP1、myocardin及其下游靶分子SM-α-actin、SM22的蛋白表達水平。
　　結果:使用不同濃度MCP1刺激人和大鼠血管平滑肌細胞發(fā)現(xiàn)，與對照組(0 ng/ml MCP1)相比，100 ng/ml MCP1處理顯著誘導人和

8、大鼠血管平滑肌細胞MCPIP1的mRNA和蛋白表達上調(diào)。與對照組（0 ng/ml MCP1）相比，100 ng/ml MCP1處理顯著誘導人和大鼠血管平滑肌細胞SM-α-actin、SM22、myocardin的mRNA和蛋白表達上調(diào)。采用攜帶MCPIP1的重組腺病毒轉染hSMCs48h發(fā)現(xiàn)，與空白對照組和Ad-GFP(空載病毒載體)組相比，Ad-MCPIP1組MCPIP1蛋白表達顯著上調(diào)。此外，Ad-MCPIP1組SM-α-actin

9、、SM22和myocardin蛋白的表達也顯著上調(diào)。
　　結論:MCPIP1可促進VSMC收縮表型標志物SM-α-actin、SM22的表達上調(diào)。此外，MCPIP1可誘導myocardin表達上調(diào)，后者可能參與介導MCPIP1對VSMC表型的調(diào)節(jié)。
　　第三章:MCP1對組織培養(yǎng)大鼠胸主動脈收縮功能的影響及相關機制探討
　　目的:我們前期體外細胞研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)MCP1處理的血管平滑肌細胞MCPIP1表達明顯上調(diào)，并伴有V

10、SMC收縮表型標志物SM-α-actin、SM22的表達上調(diào)，提示MCPIP1可參與VSMC表型分化的調(diào)節(jié)。因此，本研究擬進一步通過離體組織培養(yǎng)，觀察MCP1處理對組織培養(yǎng)血管收縮功能的影響，并初步探討MCPIP1是否參與組織培養(yǎng)時血管平滑肌細胞去分化過程。
　　方法:獲取大鼠胸主動脈，等分為長約2mm血管環(huán)，分為三組:(1)新鮮血管組;(2)無血清DMEM培養(yǎng)基中孵育72h;(3)含MCP1(100ng/ml)的無血清DMEM培

11、養(yǎng)基中孵育72h。然后將樣本用于以下實驗:(1)用myograph技術檢測血管環(huán)對KC1和PE的收縮反應;(2)用Western Blot檢測血管環(huán)MCPIP1、myocardin及其下游靶分子SM-α-actin、SM22蛋白的表達;(3)用real time qPCR檢測血管環(huán)MCPIP1、myocardin及其下游靶基因SM-α-actin、SM22 mRNA的表達。
　　結果:Myograph技術檢測發(fā)現(xiàn)，與新鮮血管環(huán)相比

12、，組織培養(yǎng)72小時的血管環(huán)對KC1和PE的收縮反應顯著下降，而MCP1處理可部分逆轉組織培養(yǎng)誘導的血管收縮功能下降。Western Blot和real time qPCR檢測發(fā)現(xiàn)與新鮮血管環(huán)相比，組織培養(yǎng)72小時的血管環(huán)MCPIP1蛋白和mRNA的表達均顯著下調(diào);而MCP1處理可部分逆轉組織培養(yǎng)誘導的MCPIP1蛋白和mRNA的表達下調(diào)。與新鮮血管環(huán)相比，組織培養(yǎng)72小時的血管環(huán)SM-α-actin、SM22、myocardin蛋白和m