氧化應(yīng)激下ABCG2基因?qū)ι窖虿G丸支持細(xì)胞的影響及作用機(jī)制.pdf

1、支持細(xì)胞(Sertoli cell)為生精細(xì)胞的分化成熟提供支架，供給生精過(guò)程所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及能量，其次還可分泌多種蛋白及生長(zhǎng)因子，具有天然的免疫豁免功能，是血睪屏障的重要組成部分，因其獨(dú)特的生物學(xué)特性，目前多用于組織工程、細(xì)胞療法，為細(xì)胞移植及糖尿病和帕金森病的治療開(kāi)辟了廣闊的前景。但在用于細(xì)胞移植時(shí)，需對(duì)支持細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，體外培養(yǎng)細(xì)胞過(guò)程是一個(gè)靜態(tài)系統(tǒng)，各種化學(xué)反應(yīng)中會(huì)產(chǎn)生過(guò)量的活性氧簇(ROS)，導(dǎo)致細(xì)胞受氧化應(yīng)激的影響而死亡

2、。近來(lái)研究表明，ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G2(ATP-binding cassette transporters G2，ABCG2)廣泛定位于各種細(xì)胞質(zhì)膜上，能夠轉(zhuǎn)運(yùn)和外排有害物質(zhì)，尤其對(duì)促進(jìn)和維持應(yīng)激狀態(tài)下細(xì)胞的穩(wěn)定增殖方面具有重要作用，而Nrf2信號(hào)通路可調(diào)節(jié)ABCG2基因的轉(zhuǎn)錄，是細(xì)胞對(duì)抗氧化損傷的核心途徑之一，因此，研究在氧化應(yīng)激條件下ABCG2基因?qū)w外培養(yǎng)的支持細(xì)胞穩(wěn)定增殖的影響及作用機(jī)制具有一定意義。
　　本試驗(yàn)首先構(gòu)建

3、山羊睪丸支持細(xì)胞(goat Sertoli cell，GSC)的氧化應(yīng)激模型，研究在氧化應(yīng)激狀態(tài)下ABCG2基因在GSC內(nèi)的表達(dá)和定位情況，闡明ABCG2基因?qū)SC穩(wěn)定增殖的影響;進(jìn)而加入ABCG2基因的抑制劑，檢測(cè)ABCG2在Nrf2信號(hào)通路中對(duì)GSC穩(wěn)定增殖的調(diào)控，以明晰氧化應(yīng)激下ABCG2基因?qū)SC穩(wěn)定增殖的影響及其作用機(jī)制。
　　第一，以GSC為研究對(duì)象，分別加入不同濃度的H2O2，作用4h后，檢測(cè)各組GSC的存活率、

4、脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物的含量、超氧化物歧化酶的活性，對(duì)GSC進(jìn)行核型分析并用流式細(xì)胞儀進(jìn)行異倍體檢測(cè)。結(jié)果顯示，構(gòu)建GSC氧化應(yīng)激模型的最佳條件是200μM H2O2處理細(xì)胞4h。
　　第二，分別對(duì)對(duì)照組和氧化應(yīng)激組的GSC進(jìn)行RNA提取，反轉(zhuǎn)錄成DNA作為模板，根據(jù)Genbank中獲得的ABCG2基因序列合成引物，普通PCR擴(kuò)增，運(yùn)用熒光定量PCR技術(shù)和免疫組化技術(shù)對(duì)ABCG2進(jìn)行表達(dá)和定位，并進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果顯示ABCG2基因在對(duì)

5、照組和氧化應(yīng)激組中均有表達(dá)，且表達(dá)量存在顯著差異，氧化應(yīng)激組ABCG2基因的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。
　　第三，對(duì)氧化應(yīng)激組的GSC加入ABCG2的抑制劑進(jìn)行處理，然后進(jìn)行RNA提取，反轉(zhuǎn)錄成DNA作為模板，根據(jù)Genbank中獲得的Nrf2信號(hào)通路上的Nrf2、HO-1、NQO1基因序列合成引物，普通PCR擴(kuò)增，運(yùn)用熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行表達(dá)并進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果顯示加抑制劑組Nrf2、HO-1、NQO1基因的表達(dá)