不同方法制備大鼠肝臟脫細(xì)胞支架及其免疫原性和細(xì)胞相容性研究.pdf

1、目前治療終末期肝病的一個(gè)有效方案是肝移植,但因?yàn)楣└尾蛔?使大多數(shù)終末期肝病患者無(wú)法獲得有效的治療。即使接受了肝移植,病人也需要終身服用免疫抑制劑。肝組織工程的發(fā)展為終末期肝病的治療提供了新的可能。本實(shí)驗(yàn)采用的全器官脫細(xì)胞支架是利用物理(振蕩,高滲,低溫等)、化學(xué)(酸、堿、去垢劑等)或酶解(胰蛋白酶、核糖核酸酶和脫氧核糖核酸酶)等方法去除器官中細(xì)胞成分和遺傳物質(zhì)后得到的生物支架。該支架保留了肝臟完整的三維立體結(jié)構(gòu)和大部分的細(xì)胞外基質(zhì)成分

2、,為后期種植種子細(xì)胞構(gòu)建組織工程肝臟提供基礎(chǔ)。目前國(guó)內(nèi)外的多家機(jī)構(gòu)通過(guò)不同的方法制備肝臟脫細(xì)胞支架,而我們?cè)谇捌谘芯恐幸怖靡訬P-40和多種生物酶為主的多步方案也成功制備出大鼠肝臟脫細(xì)胞支架。目前尚無(wú)對(duì)幾種洗脫方案系統(tǒng)化的比較。影響支架使用的一個(gè)重要因素是其免疫原性,盡管研究證實(shí)洗脫過(guò)程已去除了引起免疫反應(yīng)的細(xì)胞物質(zhì),但生物材料移植之后仍可引起強(qiáng)烈的免疫排斥反應(yīng)。影響支架使用的另一重要因素是其細(xì)胞相容性,通過(guò)在支架上種植種子細(xì)胞觀察其

3、粘附、生長(zhǎng)、分化、遷移情況,可初步判斷制備的脫細(xì)胞支架在清除掉細(xì)胞成分的同時(shí),是否保留了適于細(xì)胞生長(zhǎng)的結(jié)構(gòu)和成分。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)比兩種傳統(tǒng)方法和一種新方法制備大鼠肝臟脫細(xì)胞支架的理化性質(zhì)、免疫原性以及細(xì)胞相容性,為肝臟組織工程的體內(nèi)、體外研究奠定基礎(chǔ)。
　　目的:
　　使用不同方案制備大鼠肝臟脫細(xì)胞支架,檢測(cè)支架成分和體內(nèi)重塑反應(yīng),以及種植細(xì)胞后細(xì)胞在支架上的生長(zhǎng)情況,比較不同方法制備DLB的免疫原性和生物相容性效果。

4、　　方法:
　　1.選取文獻(xiàn)報(bào)道的三種方案(分別以SDS,TritonX-100和NP-40為主要洗脫成分),制備F344大鼠DLB。
　　2.免疫原性部分進(jìn)行HE和Masson染色,檢測(cè)DLB中DNA、氨基葡聚糖(GAG)以及羥脯氨酸(HYP)含量;再將DLB埋植于C57BL/6小鼠的背部皮下,于術(shù)后第3、7和14天取出后進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和組織學(xué)評(píng)分。
　　3.細(xì)胞相容性部分進(jìn)行氨基葡聚糖(GAG)檢測(cè)、掃描電鏡、細(xì)胞

5、毒性實(shí)驗(yàn),后經(jīng)門靜脈灌注肝卵圓細(xì)胞,進(jìn)行免疫熒光、掃描電鏡、粘附率和白蛋白分泌檢測(cè)。結(jié)果:
　　1.三種方案均成功制備出符合脫細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)的大鼠DLB;
　　2.形態(tài)學(xué)結(jié)果提示TritonX-100和NP-40方案較SDS方案能更好地保護(hù)肝臟超微結(jié)構(gòu);成分檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)NP-40方案去除DNA的能力顯著強(qiáng)于SDS和TritonX-100方案(P<0.05),而對(duì)GAG含量的洗脫作用最弱(P<0.05);異種體內(nèi)埋置實(shí)驗(yàn)提示NP-4

6、0方案制備的DLB引起的免疫反應(yīng)強(qiáng)度明顯弱于SDS和TritonX-100方案,體內(nèi)重塑結(jié)局評(píng)分顯著高于SDS和TritonX-100方案。
　　3.大體觀察、掃描電鏡及孔徑計(jì)算表明NP-40方案細(xì)胞外基質(zhì)較SDS和TritonX-100方案整齊;GAG檢測(cè)NP-40方案高于TritonX-100方案和SDS方案;支架細(xì)胞毒性結(jié)果證實(shí)支架對(duì)細(xì)胞增殖起促進(jìn)作用;細(xì)胞粘附率結(jié)果表明NP-40方案高于SDS方案和TritonX-100方

7、案;免疫熒光及掃描電鏡示NP-40方案細(xì)胞排列整齊;白蛋白分泌NP-40方案(85.77±3.30mg/106個(gè)細(xì)胞)明顯好于SDS方案(49.37±2.43mg/106個(gè)細(xì)胞)和TritonX-100方案(74.66±4.80mg/106個(gè)細(xì)胞)。
　　結(jié)論:
　　與SDS和TritonX-100方案相比,NP-40方案能更有效地去除肝臟DNA,較好地保留GAG,誘導(dǎo)移植受體對(duì)DLB的良性重塑反應(yīng),且有利于細(xì)胞在支架上的粘