表達(dá)HIV-1外膜蛋白細(xì)胞模型的構(gòu)建及鑒定.pdf

1、艾滋病，即獲得性免疫缺陷綜合征，是當(dāng)前威脅人類(lèi)生命健康與全球公共衛(wèi)生安全的最大問(wèn)題，也被稱(chēng)為“超級(jí)癌癥”和“世紀(jì)殺手”。人類(lèi)免疫缺陷病毒（HIV）是其主要病原體。它在分類(lèi)學(xué)上屬于反轉(zhuǎn)錄病毒科、慢病毒屬、靈長(zhǎng)類(lèi)慢病毒群。HIV是一種能攻擊人體免疫系統(tǒng)的病毒。它把人體免疫系統(tǒng)中最重要的T4淋巴細(xì)胞作為攻擊目標(biāo)，大量破壞T4淋巴細(xì)胞，導(dǎo)致淋巴細(xì)胞的大量衰竭。HIV本身并不會(huì)引發(fā)任何疾病，而是當(dāng)免疫系統(tǒng)被 HIV破壞后，人體由于抵抗能力過(guò)低，導(dǎo)

2、致各種機(jī)會(huì)性感染或腫瘤而造成死亡。
　　雖然全世界眾多優(yōu)秀的醫(yī)學(xué)研究人員付出了巨大的努力，但至今尚未研制出根治艾滋病的特效藥物，也沒(méi)有研究出用于預(yù)防的有效疫苗。目前，該病病死率幾乎高達(dá)100％，已被我國(guó)列入乙類(lèi)法定傳染病，并被列為國(guó)境衛(wèi)生監(jiān)測(cè)傳染病之一。而制約抗艾滋特效藥物及治療性疫苗進(jìn)一步發(fā)展的原因之一，是缺少簡(jiǎn)便有效的測(cè)試模型來(lái)評(píng)價(jià)其效果。用細(xì)胞作為模型進(jìn)行檢測(cè)，由于避免了直接使用毒株或組織所存在的危險(xiǎn)性及難于操作等缺點(diǎn)，是目

3、前用來(lái)進(jìn)行臨床試驗(yàn)前不可或缺的一個(gè)環(huán)節(jié)。
　　本研究選擇慢病毒穿梭質(zhì)粒載體pLVX，插入HIV-1外膜蛋白基因gp120，以空載體作為陽(yáng)性對(duì)照，結(jié)合慢病毒包裝質(zhì)粒載體pLP1（gag/pol）、pLP2（rev）、pLP-VSVG，共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，以期包裝出具有單輪感染活性的假型重組慢病毒，用其感染小鼠乳腺癌細(xì)胞4T1，外源基因可通過(guò)慢病毒整合到靶細(xì)胞基因組中。通過(guò)熒光挑斑純化，得到陽(yáng)性克隆細(xì)胞，利用熒光顯微鏡觀察、PCR、R

4、T-PCR、Western Blot、ELISA等方法檢測(cè)gp120基因的整合、轉(zhuǎn)錄、表達(dá)以及結(jié)合活性。
　　研究結(jié)果顯示，成功構(gòu)建表達(dá)HIV-1外膜蛋白慢病毒重組質(zhì)粒pLV-120，RT-PCR、Western Blot及激光掃描共聚焦顯微鏡檢測(cè)，目的蛋白在細(xì)胞表面得到良好表達(dá)。成功包裝出具有單輪感染活性的假型重組慢病毒 LV-120和 LV-ZsGreen1，病毒粒子外觀完整，纖突整齊而致密，病毒滴度較高。感染4T1后經(jīng)PCR

5、、RT-PCR成功擴(kuò)增出1596 bp的目的條帶，表明gp120基因成功整合、轉(zhuǎn)錄。熒光顯微鏡下觀察到亮綠色熒光，并且Western Blot檢測(cè)出120 kDa的目的條帶，表明GP120蛋白得到良好表達(dá)。ELISA檢測(cè)結(jié)果表明，細(xì)胞模型與重組導(dǎo)向制劑有良好的結(jié)合活性。通過(guò)上述研究，利用慢病毒載體系統(tǒng)成功建立了能夠準(zhǔn)確表達(dá)HIV-1外膜蛋白的靶細(xì)胞模型，為下一步抗AIDS/HIV治療性疫苗及基因工程靶向制劑或抗病毒藥物的研制提供體外細(xì)胞