細胞自噬在肝癌細胞內質網應激性死亡中的作用及對藥物敏感性的影響.pdf

1、研究背景:原發(fā)性肝細胞癌(HCC)惡性程度高、預后差,是危害我國居民健康的重大疾病,而其多藥耐藥(MDR)現(xiàn)象更是影響內科藥物治療療效的重要因素。深入探討HCC惡性增殖和藥物抵抗的機制、尋找有效的干預靶點已經成為肝癌研究的熱點。肝癌細胞始終處于病毒感染、營養(yǎng)缺乏、炎癥刺激等各種不良的微環(huán)境中,這些不良刺激加上腫瘤的惡性增殖會使得大量未折疊/錯誤折疊蛋白在內質網腔內的積聚,導致內質網應激(ERS)狀態(tài)。研究證實,ERS以及其引發(fā)的未折疊蛋

2、白反應(UPR)與眾多的細胞內信號轉導途徑相關,因此探討ERS狀態(tài)下的肝癌細胞增殖、生存和死亡的機制具有重要的意義。自噬是細胞在缺氧、營養(yǎng)缺乏環(huán)境下通過自身降解來維持生存和細胞穩(wěn)態(tài)的重要機制。近年研究表明,自噬與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及腫瘤的治療均有密切關系,但自噬究竟是發(fā)揮促癌還是抑癌的作用目前尚無定論。研究ERS狀態(tài)下肝癌細胞的自噬活性的變化,以及自噬在肝癌細胞生存和死亡中的作用有助于進一步闡明肝癌的惡性生物學的分子基礎和藥物抵抗機制。

3、r>　　研究目的:①觀察ERS誘導劑衣霉素(TM)對肝癌細胞自噬活性的影響;②研究細胞自噬在ERS誘導的肝癌細胞死亡中的作用;③探討化療藥物對肝癌細胞自噬的影響及調控自噬對肝癌細胞藥物敏感性的影響。
　　方法:肝癌細胞株HepG2、HepG2.2.15和Bel7402分別培養(yǎng)于含10％胎牛血清的DMEM、MEM和RPMI1640培養(yǎng)基中;正常肝細胞L02培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM中。采用CCK?8法檢測細胞活力,并根據(jù)細胞活

4、力值在OriginPro8.5.1軟件中進行劑量效應曲線擬合,分別計算TM及奧沙利鉑(Oxa)對各細胞株的半數(shù)抑制濃度(IC50),據(jù)此設計自噬誘導試驗的濃度。免疫印跡法檢測ERS標志蛋白GRP78的表達及caspase?3蛋白的切割情況。自噬的檢測與評價包括以下4個方面:a)形態(tài)學定性:采用透射電子顯微鏡法(TEM)觀察自噬體的超微結構,以EBSS和雷帕霉素處理的細胞作為自噬誘導的陽性對照;b)細胞爬片經免疫熒光染色,在激光共聚焦顯微

5、鏡下觀察LC3蛋白在胞漿內的定位表達情況;c)免疫印跡法檢測自噬性LC3Ⅰ蛋白向LC3Ⅱ蛋白的轉變(conversion試驗)并進行定量分析;d)自噬潮(autophagicflux)分析:以氯喹(CQ)作為溶酶體抑制劑,觀察CQ存在與不存在的情況下LC3Ⅱ蛋白表達的變化(LC3turnover試驗),以全面評價自噬性降解功能。
　　結果:①肝癌細胞和正常細胞對ERS刺激的耐受性:在相同濃度TM刺激下,3種肝癌細胞株(HepG2、

6、HepG2.2.15和Bel7402)的細胞活力均高于正常肝細胞L02的活力。②ERS誘導劑對HepG2細胞活力的影響:HepG2細胞的活力隨TM作用時間的延長和劑量的增加而下降;經計算后,TM對HepG2細胞的IC50值=6.4606μg/ml;且TM處理的HepG2細胞中見caspase3蛋白的切割現(xiàn)象。③HepG2細胞內ERS標志蛋白GRP78表達的變化:免疫印跡檢測證實,TM刺激可以引起HepG2細胞GRP78蛋白表達的上調。G

7、RP78蛋白表達水平與TM的濃度呈正相關,且隨著TM作用時間的延長,GRP78表達水平逐漸增加。④ERS對肝癌HepG2細胞自噬的影響:a)TEM觀察發(fā)現(xiàn),2.5μg/mlTM作用24小時后的HepG2細胞中自噬體(即包裹著胞漿成分的囊泡樣結構)較對照組明顯增多。b)激光共聚焦顯微鏡下亦發(fā)現(xiàn)LC3蛋白在TM處理后的HepG2細胞中的表達明顯增加,呈點狀聚集現(xiàn)象。c)WesternBlot證實ERS后的HepG2細胞出現(xiàn)了自噬性的LC3Ⅰ

8、向LC3Ⅱ轉變。2.5μg/ml和5μg/ml的TM作用于HepG2后,與對照組相比,LC3Ⅰ蛋白表達下調,同時LC3Ⅱ蛋白表達上調;條帶定量分析的結果提示TM處理組的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ光密度比值大于對照組,且LC3Ⅱ/LC3Ⅰ光密度比值隨TM處理時間的增加而增加;而自噬抑制劑3?甲基腺嘌呤(3MA)可抑制LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的轉變。d)自噬潮分析(LC3turnover試驗)的結果示:CQ抑制溶酶體后,LC3Ⅱ蛋白表達水平較不加CQ的相

9、同濃度的TM組明顯增多;定量分析結果提示TM+CQ組的LC3Ⅱ光密度值較不加CQ的相同濃度TM組增加;同時,TEM亦證實CQ存在時,TM處理的HepG2細胞中出現(xiàn)更多的自噬體的積聚。以上結果說明了ERS誘導的HepG2細胞自噬增加是自噬功能增強的結果,而非自噬性降解缺陷所致自噬體積聚。⑤抑制自噬對ERS狀態(tài)下HepG2細胞活力的影響:在加入TM前1小時加入3MA用來抑制自噬的發(fā)生,結果發(fā)現(xiàn)抑制自噬可增加ERS狀態(tài)下的HepG2細胞死亡;

10、提高3?MA濃度,細胞活力下降更明顯。而提前加入CQ則對ERS狀態(tài)下的肝癌細胞活力影響不大。⑥奧沙利鉑(Oxa)對HepG2細胞自噬的影響:電鏡下,Oxa作用下的HepG2細胞自噬體增加;Western Blot證實Oxa誘導LC3 Ⅱ蛋白的表達增加,而且CQ抑制溶酶體后LC3?Ⅱ蛋白的表達進一步增加。以上結果說明Oxa可以誘導HepG2細胞的自噬增加。⑦自噬抑制對肝癌細胞藥物敏感性的影響:3MA可以下調LC3Ⅱ的表達,抑制自噬的發(fā)生。

11、3MA+Oxa共處理可以引起肝癌HepG2和HepG2.2.15細胞活力的顯著下降。CQ+Oxa聯(lián)合處理24小時對肝癌細胞活力影響不大,48小時后的活力則較Oxa單獨處理組明顯下降。
　　結論:與正常肝細胞相比,肝癌細胞對ERS刺激的耐受性更強;ERS可以誘導肝癌HepG2細胞自噬的形成增加和自噬潮的增強,且隨著ERS誘導劑TM作用時間和劑量的增加而增加;自噬活性增強是肝癌HepG2細胞耐受ERS刺激的重要機制,自噬抑制劑3MA可