活性氧調(diào)控血小板凋亡及輻射對(duì)產(chǎn)板型巨核Meg-01細(xì)胞影響的初步研究.pdf

1、目的：研究Dibucaine(辛可卡因)和Thrombin(凝血酶)對(duì)血小板作用過(guò)程中活性氧的產(chǎn)生及抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)對(duì)其引起凋亡或酶切的作用,以及X射線對(duì)血小板凋亡和巨核細(xì)胞增殖分化等影響并探討可能機(jī)制;
　　方法：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)活性氧的產(chǎn)生、血小板GPIba的表達(dá)和線粒體膜電位的去極化;Western-blot法測(cè)定凋亡蛋白Caspase-3和抗凋亡蛋白Bcl-xL的表達(dá)水平和血小板酶切片段GC的表達(dá)。予以Me

2、g-01細(xì)胞1、3、5、7(Gy)的X射線照射,CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖能力,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞CD41和GPIba的表達(dá)以及Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。
　　結(jié)果：Dibucaine和Thrombin處理的血小板產(chǎn)生活性氧較對(duì)照組分別增加約1.64倍和1.5倍,而用NAC預(yù)處理組活性氧的產(chǎn)生明顯低于刺激組。Dibucaine單獨(dú)處理的血小板膜糖蛋白GPIba的表達(dá)明顯減少,且離心后的上清中

3、GC片段明顯增多;而予以NAC(N-乙酰半胱氨酸)、DTT(二硫蘇糖醇)等還原劑預(yù)先處理后再予以Dibucaine處理,血小板GPIba的表達(dá)減低明顯受到抑制,上清液GC片段的表達(dá)也明顯降低。Dibucaine處理組中△Ψm正常血小板為(13.52±3.01)％,NAC+Dibucaine組為(86.30±9.37)％;Thrombin處理組中△Ψm正常的血小板為(76.58±5.28)％, NAC+Thrombin組為(93.00±3

4、.03)％,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.001)。Dibucaine處理的血小板,Caspase-3被激活后裂解的小片段明顯多于DMSO對(duì)照組;預(yù)先用NAC處理血小板,再予Dibucaine處理,Caspase-3活化后裂解的小片段明顯減少;Dibucaine或Thrombin處理的血小板抗凋亡蛋白Bcl-xL的表達(dá)較DMSO對(duì)照組或空白組比較均有所減少;NAC預(yù)處理血小板后再予以Dibucaine或Thrombin處理,Bcl-x

5、L的表達(dá)較Dibucaine或Thrombin單獨(dú)處理組明顯增多。予以2.5Gy~10Gy X射線照射,血小板線粒體膜電位和GPIba有小幅波動(dòng),但沒有顯著性差異。產(chǎn)板型巨核Meg-01細(xì)胞受到劑量大于3Gy的單次X射線照射后24小時(shí),增殖能力較對(duì)照組明顯受到抑制,CD41或GPIba的表達(dá)較對(duì)照組明顯增多,細(xì)胞受到照射后48小時(shí),凋亡較對(duì)照組比較無(wú)顯著差異,但3Gy以上照射的細(xì)胞壞死較對(duì)照比較有明顯差異。
　　結(jié)論：Dibuca

6、ine或Thrombin引起的血小板凋亡過(guò)程中,活性氧參與了其酶切和凋亡的調(diào)控;抗氧化劑NAC可明顯抑制Dibucaine或Thrombin引起的血小板酶切與凋亡,并且主要是通過(guò)對(duì)活性氧的抑制或清除來(lái)發(fā)揮抗凋亡等作用的;2.5Gy~10Gy的X射線照射不能引起血小板的凋亡與酶切。產(chǎn)板型巨核Meg-01細(xì)胞受到劑量大于3Gy的單次X射線照射,增殖明顯受到抑制,而分化程度明顯增加,細(xì)胞有晚期壞死的發(fā)生。此研究結(jié)果對(duì)進(jìn)一步探討血栓與止血、血小