YABBY5和CRC基因在佛手果實(shí)發(fā)育中的功能初探.pdf

1、佛手（Citrus medica var.L.sarcodactylis Swingle）是蕓香科(Rutaceae)柑橘屬（Citrus spp.）植物，屬于香櫞（C medica L.）的變種。佛手本身果實(shí)奇特，與香櫞親緣關(guān)系很相近，但二者的果實(shí)形態(tài)有著極大差異。CRABS CLAW(CRC)和YABBY5基因都是YABBY基因家族成員，屬于植物中特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)于植物的生長(zhǎng)發(fā)育及形態(tài)建成具有重要的生物學(xué)功能。
　　本研

2、究用形態(tài)學(xué)手段觀察佛手果形早期發(fā)育的歷程，并以金華青皮佛手和香櫞為材料，克隆分析CRC和YABBY5基因的序列結(jié)構(gòu)，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)及病毒誘導(dǎo)的基因沉默(virus induced gene silencing，VIGS)技術(shù)分析兩個(gè)YABBY基因家族成員的表達(dá)和功能特性。
　　1.采集1mm、1.5mm、2mm、2.5mm、3mm、3.5mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm佛手花芽、開(kāi)花當(dāng)天佛

3、手花及開(kāi)花后佛手幼果。通過(guò)超景深顯微鏡和掃描電鏡觀察不同發(fā)育階段的佛手花芽形態(tài)，結(jié)果顯示，當(dāng)芽體約1mm時(shí)進(jìn)入花萼分花期，約2mm時(shí)進(jìn)入雄蕊分化期(SD)，約3～4mm時(shí)進(jìn)入雌蕊分化期(GD)。且早期花芽心皮原基就已出現(xiàn)了指狀突起，這些指狀凸起包含柱頭和花柱，但是隨著花的開(kāi)放，柱頭早落，子房也出現(xiàn)了的指狀凸起。由此表明，佛手指狀部分由雌蕊子房發(fā)育而來(lái)，果形建成于開(kāi)花前。
　　2.通過(guò)甜橙基因組數(shù)據(jù)分析設(shè)計(jì)相關(guān)引物，以香櫞為對(duì)照材料

4、，分別在佛手、香櫞中克隆了CRC基因啟動(dòng)子序列和YABBY5基因gDNA和cDNA全長(zhǎng)序列。在NCBI中比對(duì)佛手、香櫞CRC啟動(dòng)子的基因序列，相似度為98％。通過(guò)PlantCARE軟件對(duì)CRC啟動(dòng)子進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)兩段序列中均含有多種高等植物基因啟動(dòng)子的保守功能元件，說(shuō)明該序列具有啟動(dòng)子活性。但與香櫞相比，佛手CRC啟動(dòng)子缺失兩個(gè)TATA-Box元件，推測(cè)CRC啟動(dòng)子在佛手中缺失序列可能引起CRC表達(dá)受影響。將佛手與香櫞YABBY5基

5、因序列與氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，佛手YABBY5基因cDNA序列與香櫞比對(duì)缺失21bp，其氨基酸序列與香櫞相比缺失7個(gè)氨基酸，且缺失序列出現(xiàn)在其保守區(qū)域(CDs)，因此認(rèn)為YABBY5基因可能會(huì)影響佛手的果實(shí)發(fā)育。
　　3.分別在佛手雄蕊分化期(SD)、雌蕊分化期(GD)、開(kāi)花前6天、開(kāi)花當(dāng)天、花后3天、花后6天及后9天等不同發(fā)育時(shí)期進(jìn)行取樣，利用qRT-PCR技術(shù)對(duì)兩個(gè)基因的表達(dá)情況進(jìn)行分析。對(duì)CRC和YABBY5在佛手、

6、香櫞花器官不同時(shí)期的表達(dá)量檢測(cè)顯示，CRC基因在佛手開(kāi)花前后表達(dá)下調(diào)，且在花器官發(fā)育各時(shí)期的表達(dá)量均顯著低于香櫞;YABBY5基因在佛手開(kāi)花前后表達(dá)上調(diào)，但在各時(shí)期的表達(dá)量也都顯著低于香櫞。前期研究表明，佛手經(jīng)高溫誘導(dǎo)后會(huì)產(chǎn)生近似香櫞的拳狀果形。將新梢停長(zhǎng)的佛手分別置于20℃和5℃處理60天，再于25/18℃恒溫培養(yǎng)至花芽形態(tài)分化期進(jìn)行取樣，檢測(cè)高低溫誘導(dǎo)后佛手花器官不同時(shí)期的表達(dá)量。結(jié)果顯示:在開(kāi)花前3天、開(kāi)花當(dāng)天和開(kāi)花后3天，高溫誘

7、導(dǎo)后CRC基因表達(dá)水平顯著高于低溫誘導(dǎo)的情況，且花后表達(dá)水平降低;高溫誘導(dǎo)后YABBY5基因在花后的表達(dá)水平均高于低溫誘導(dǎo)的表達(dá)水平，其中開(kāi)花三天內(nèi)差異最顯著。從表達(dá)趨勢(shì)分析，CRC、YABBY5基因在高溫誘導(dǎo)后佛手花器官的表達(dá)情況更接近香櫞，由此說(shuō)明，以上兩個(gè)YABBY基因與佛手的果形建成相關(guān)。
　　4.以子葉出土后30天左右的番茄Micro-Tom進(jìn)行試驗(yàn)，利用VIGS技術(shù)沉默番茄SlYABBY5b基因cDNA片段。結(jié)果顯示:

8、沉默SlYABBY5基因的植株在處理30d后穩(wěn)定坐果，且果實(shí)上端拉長(zhǎng)變尖近梨形或出現(xiàn)凸起，此表型一直持續(xù)到處理后60d，但果實(shí)的轉(zhuǎn)色并未受到影響。在陰性對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組中各選取25個(gè)番茄果實(shí)，經(jīng)過(guò)Tomato Analyzer3.0軟件分析，SlYABBY5沉默30-60d左右的番茄果被拉長(zhǎng)，且沉默組果實(shí)果尖夾角顯著小于對(duì)照組果實(shí)(P＜0.01)。果實(shí)高度在46-63mm的區(qū)間內(nèi)，沉默果實(shí)數(shù)目大于對(duì)照組;果尖角度在80°-119°的范圍內(nèi)

9、，沉默組果實(shí)數(shù)目是對(duì)照組的2倍。利用STRING網(wǎng)站及參考相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)YABBY5互作基因進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)在擬南芥中，KAN、KAN2、ETT、WOX1、AT4G38840.1、SUN和OVATE七個(gè)基因可能與YABBY5互作。檢測(cè)YABBY5及其預(yù)測(cè)互做基因在對(duì)照組與沉默組果實(shí)中的表達(dá)水平。結(jié)果表明，SlYABBY5基因在沉默果實(shí)中表達(dá)量下降，其它基因的表達(dá)水平也出現(xiàn)變化?？梢?jiàn)，YABBY5基因的下調(diào)會(huì)影響果實(shí)形狀，作為轉(zhuǎn)錄因子也能影