CD147上調(diào)表達(dá)與結(jié)腸癌耐藥及腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系及機(jī)制研究.pdf

1、本文主要從以下幾方面進(jìn)行了論述：
　　第一部分 CD147在結(jié)腸癌組織及結(jié)腸癌細(xì)胞中的表達(dá)情況
　　目的：研究結(jié)腸癌組織及結(jié)腸癌細(xì)胞株中的CD147表達(dá)情況。
　　方法：收集2013年到2014年間在山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院胃腸外科由同一手術(shù)團(tuán)隊(duì)確診并行根治性手術(shù)的結(jié)腸癌患者40例。根據(jù)患者性別、年齡、腫瘤分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、局部浸潤(rùn)情況、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況分別進(jìn)行分組計(jì)數(shù)，選取結(jié)腸癌組織細(xì)胞及對(duì)應(yīng)的切緣腫瘤檢測(cè)陰性的正常結(jié)腸

2、組織細(xì)胞，分別采用實(shí)時(shí)定量PCR(quantificational real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)及蛋白印跡法(Western blot)分別對(duì)兩組細(xì)胞中CD147表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)選取購自于中國(guó)科學(xué)院生物細(xì)胞庫的結(jié)腸癌細(xì)胞株Caco-2，SW480，HCT116， HCT15，分別采用實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)及蛋白印跡法(Western blot)分別對(duì)四組細(xì)胞中C

3、D147表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，明確CD147在上述組織及細(xì)胞中的表達(dá)情況，并用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析其差異性。同時(shí)根據(jù)CD147在結(jié)腸癌組織的表達(dá)高低對(duì)40例病例進(jìn)行了分組，并與患者的臨床病理因素分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以探討CD147表達(dá)在結(jié)腸癌組織中表達(dá)與結(jié)腸癌不同的臨床病理因素的相關(guān)性。
　　結(jié)果：結(jié)腸癌組織試驗(yàn)中，mRNA檢測(cè)中有55％(22/40)的病例是高表達(dá)的，而蛋白檢測(cè)中62.5％(25/40)是呈高表達(dá)的。同時(shí)結(jié)腸癌細(xì)胞系SW4

4、80，Caco-2，HCT116， HCT15中CD147均呈高表達(dá)，其中SW480細(xì)胞系具有最高的表達(dá)，而Caco-2細(xì)胞系呈現(xiàn)出最低的表達(dá)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)腸癌組織中CD147表達(dá)情況與結(jié)腸癌臨床病理因素的關(guān)系，我們根據(jù)結(jié)腸癌組織中CD147表達(dá)的高低進(jìn)行分組，分組依據(jù)為表達(dá)相差1.5倍。然后與患者臨床病理因素進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(P＜0.05)，結(jié)果表明，性別因素:P=0.804，年齡因素:P=0.8，腫瘤分分化程度:P=0.673，局

5、部浸潤(rùn)情況:P=0.055，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移:P=0.033，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移:P=0.327。這表明CD147的上調(diào)表達(dá)與結(jié)腸癌浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移存在相關(guān)性。
　　結(jié)論：明確了CD147在結(jié)腸癌組織及結(jié)腸癌細(xì)胞株中均存在表達(dá)，在4組結(jié)腸癌細(xì)胞株中，SW480細(xì)胞系具有最高的表達(dá)，而Caco-2細(xì)胞系呈現(xiàn)出最低的表達(dá)。結(jié)腸癌組織中CD147的上調(diào)表達(dá)與結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移存在相關(guān)性。
　　第二部分 CD147的上調(diào)表達(dá)與結(jié)腸癌耐藥及腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系

6、r>　　目的：進(jìn)一步通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究CD147上調(diào)表達(dá)與結(jié)腸癌耐藥及腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系
　　方法：根據(jù)第一部分實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌細(xì)胞株中表達(dá)差異明顯的兩組細(xì)胞株SW480，Caco-2。本部分實(shí)驗(yàn)中，我們選取這兩組細(xì)胞系進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，在Caco-2中分別轉(zhuǎn)染入CD147高表達(dá)質(zhì)粒，及陰性對(duì)照組的空載質(zhì)粒，分別命名為Caco-OvCD147及Caco-cCD147。在結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480分別轉(zhuǎn)染SiRNA載體質(zhì)粒和對(duì)照

7、空載質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株分別命名為SW480-SiCD147和SW480-cCD147。經(jīng)過篩選培養(yǎng)穩(wěn)定的克隆細(xì)胞株，然后分別進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR及western blot實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證新建立的細(xì)胞株中的CD147表達(dá)情況。然后選用CCK-8實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證CD147誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)5-FU的耐藥，選用Transwell實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證CD147對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲能力的影響，選用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證CD147對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞遷移能力的影響。
　　結(jié)果：通過細(xì)胞轉(zhuǎn)

8、染實(shí)驗(yàn)建立了兩組CD147具有顯著差異的細(xì)胞株Caco-OvCD147和Caco-cCD147以及SW480-SiCD147和SW480-cCD147，并通過qRT-PCR及Western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)轉(zhuǎn)染后各組新的細(xì)胞株中CD147的表達(dá)情況。經(jīng)過轉(zhuǎn)染后的新的細(xì)胞株表明Caco-OvCD147中CD147的表達(dá)明顯高于Caco-cCD147;而SW480-SiCD147細(xì)胞中CD147的表達(dá)明顯低于SW480-cCD147。CCK

9、-8實(shí)驗(yàn)表明CD147過表達(dá)的Caco-OvCD147的結(jié)腸癌細(xì)胞在5-FU刺激下存活明顯高于對(duì)照組Caco-cCD147，而經(jīng)過轉(zhuǎn)染小干擾RNA的SW480-SiCD147結(jié)腸癌細(xì)胞存活明顯低于對(duì)照組SW480-cCD147。Transwell實(shí)驗(yàn)表明，Caco-OvCD147細(xì)胞株的侵襲能力明顯優(yōu)于Caco-cCD147，而SW480-SiCD147的侵襲能力弱于SW480-cCD147。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)則表明Caco-OvCD147細(xì)

10、胞株的細(xì)胞遷移能力明顯優(yōu)于Caco-cCD147，而SW480-SiCD147的遷移能力弱于SW480-cCD147。
　　結(jié)論：CCK-8實(shí)驗(yàn)表明CD147上調(diào)表達(dá)的的細(xì)胞株能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞對(duì)5-FU的耐藥，而Transwell實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)則表明CD147上調(diào)表達(dá)的細(xì)胞株侵襲轉(zhuǎn)移能力明顯增強(qiáng)。從而證明了CD147的上調(diào)表達(dá)與結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移有明顯相關(guān)性。
　　第三部分 EMT過程及MAPK/ERK通路參與CD147介導(dǎo)的

11、結(jié)腸癌腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的研究
　　目的：研究細(xì)胞上皮間質(zhì)過渡過程EMT及MAPK/ERK信號(hào)通路在CD147介導(dǎo)的結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移過程中作用。
　　方法：通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)建立了兩組CD147表達(dá)水平具有顯著差異的細(xì)胞株Caco-OvCD147和Caco-cCD147以及SW480-SiCD147和SW480-cCD147，并通過qRT-PCR及Western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)轉(zhuǎn)染后各組新的細(xì)胞株中CD147的表達(dá)情況。然后通過實(shí)時(shí)

12、定量PCR及western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的各細(xì)胞系中EMT過程中的標(biāo)志物E-cadherin、vimentin以及金屬基質(zhì)蛋白酶MMP-2，MMP-9的表達(dá);同時(shí)用qRT-PCR及Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞株的pERK及總ERK水平。為了進(jìn)一步驗(yàn)證MAPK通路參與CD147介導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移，先用MEK抑制劑U0126干預(yù)處理處理了Caco-OvCD147和Caco-cCD147細(xì)胞株，然后通過Tra

13、nswell實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證處理后的細(xì)胞的侵襲遷移能力，并且用Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了經(jīng)U0126處理后兩組細(xì)胞系Caco-OvCD147和Caco-cCD147中MMP-2，MMP-9的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：在CD147過表達(dá)的Caco-OvCD147細(xì)胞株較Caco-cCD147中E-cadherin是表達(dá)下調(diào)的，vimentin的表達(dá)是上調(diào)的，金屬基質(zhì)蛋白酶MMP-2，MMP-9的表達(dá)是上調(diào)的，在SW4

14、80-SiCD147細(xì)胞株較SW480-cCD147中，E-cadherin是表達(dá)上調(diào)的，vimentin的表達(dá)是下調(diào)的，金屬基質(zhì)蛋白酶MMP-2，MMP-9的表達(dá)是下降的，CD147的上調(diào)表達(dá)的細(xì)胞株Caco-OvCD147中pERK的表達(dá)較Caco-cCD147明顯增高，轉(zhuǎn)染SiRNA的細(xì)胞株SW480-SiCD147中pERK的表達(dá)水平較SW480-cCD147的表達(dá)水平明顯減少，然而總的ERK水平是不變的。經(jīng)過U0126干預(yù)處理

15、的細(xì)胞株Caco-OvCD147中MMP-2， MMP-9表達(dá)水平較經(jīng)U0126干預(yù)處理的Caco-cCD147水平減少。Transwell實(shí)驗(yàn)表明經(jīng)過U0126干預(yù)處理的細(xì)胞株Caco-OvCD147細(xì)胞侵襲能力弱于經(jīng)U0126干預(yù)處理的Caco-cCD147細(xì)胞;細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)表明經(jīng)過U0126干預(yù)處理的細(xì)胞株Caco-OvCD147細(xì)胞遷移能力弱于經(jīng)U0126干預(yù)處理的Caco-cCD147細(xì)胞。
　　結(jié)論：細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明C