石斛多糖干預(yù)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂及成骨分化的研究.pdf

1、近年來(lái)，天然藥物逐漸引起了人們的重視，天然藥物作為藥物在臨床上也得到了廣泛應(yīng)用。石斛是我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥，藥效顯著，應(yīng)用歷史悠久，其具有的諸多功效已在幾千年的中醫(yī)臨床實(shí)踐中得到驗(yàn)證。本論文主要研究了鐵皮石斛（Dendrobium officinale）和銅皮石斛（Dendrobium moniliforme）多糖對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）成脂及成骨分化的影響，并嘗試通過(guò)現(xiàn)代

2、分子生物學(xué)理論來(lái)解釋石斛“滋陰補(bǔ)腎”的傳統(tǒng)功效，為今后更好的利用中藥石斛資源提供科學(xué)依據(jù)。
　　本實(shí)驗(yàn)內(nèi)容主要包括以下4個(gè)部分：
　　1.采用常規(guī)的溶劑浸提法提取鐵皮石斛多糖和銅皮石斛多糖，并通過(guò)乙醇沉淀，Sevage法除蛋白等一系列操作對(duì)石斛多糖進(jìn)行初步分離純化。所提取的鐵皮石斛多糖得率為20.4％，銅皮石斛多糖得率為10.6%。濃硫酸-苯酚比色法測(cè)得本次實(shí)驗(yàn)中所提取的鐵皮石斛和銅皮石斛粗多糖中多糖含量分別為76.4%、6

3、7.5%，表明所提取的石斛多糖具有比較高的純度。
　　2.采用全骨髓貼壁篩選法分離得到SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs），并進(jìn)行傳代培養(yǎng)，倒置顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察，并采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面特異性標(biāo)志物的表達(dá)情況。臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測(cè)細(xì)胞活力，噻唑藍(lán)（MTT）比色法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線及不同石斛多糖對(duì)BMSCs生存率的影響。結(jié)果表明：分離得到的大鼠BMSCs在顯微鏡下呈紡錘形、梭形、漩渦狀生長(zhǎng)，形態(tài)均一，細(xì)胞活力可達(dá)95%以上

4、。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)正常，基本不表達(dá)造血細(xì)胞標(biāo)志物CD45，表達(dá)CD105。細(xì)胞生存率實(shí)驗(yàn)表明質(zhì)量濃度為50～800μg/mL的鐵皮石斛和銅皮石斛多糖對(duì)BMSCs的生存率無(wú)顯著影響，表明在此濃度范圍內(nèi)石斛多糖對(duì)BMSCs無(wú)細(xì)胞毒性。
　　3.誘導(dǎo)BMSCs成脂分化，添加質(zhì)量濃度為50～800μg/mL的鐵皮石斛和銅皮石斛多糖分別進(jìn)行干預(yù)，干預(yù)成脂分化10天、20天后，油紅O染色并定量檢測(cè)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)過(guò)氧化

5、物酶體增殖物激活受體γ（PPARG）、脂蛋白脂肪酶（LPL）、脂肪酸結(jié)合蛋白4（FABP4）的mRNA表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：質(zhì)量濃度為400、800μg/mL的鐵皮石斛和銅皮石斛多糖均能顯著降低油紅O染色后的吸光值，下調(diào)PPARG、LPL、FABP4的mRNA表達(dá)。結(jié)果表明，在一定質(zhì)量濃度下，兩種石斛多糖可顯著抑制BMSCs成脂分化。
　　4.誘導(dǎo)BMSCs成骨分化，添加質(zhì)量濃度為50～800μg/mL的鐵皮石斛和銅皮石斛多糖分別進(jìn)

6、行干預(yù)，干預(yù)成骨分化7天后，進(jìn)行堿性磷酸酶（ALP）染色、誘導(dǎo)分化28天后，進(jìn)行茜素紅染色。用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)核心結(jié)合因子α1（CBFα1）、I型膠原（COL I）、骨橋蛋白（OP）的mRNA表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：成骨誘導(dǎo)后的細(xì)胞能被堿性磷酸酶及茜素紅染成紅色。鐵皮石斛多糖對(duì)成骨分化標(biāo)志基因的表達(dá)無(wú)顯著影響，而銅皮石斛多糖在質(zhì)量濃度為200μg/mL時(shí)能顯著升高成骨分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子核心結(jié)合因子α1（CBFα1）和成骨分化早期標(biāo)志基