何首烏飲對自然衰老大鼠精子質量的影響.pdf

1、何首烏飲由何首烏、肉蓯蓉、懷牛膝、淫羊霍、丹參、茯苓六味中藥配方而成。
　　目的:研究何首烏飲對自然衰老大鼠精子質量的影響。
　　方法:
　　1.實驗動物與分組
　　選用12月齡Wistar大鼠70只,將動物分為青年對照組,自然衰老組,何首烏丸組,何首烏飲1組、2組。青年對照組在12月時取材;自然衰老組在飼養(yǎng)到16月時灌胃等量的生理鹽水;何首烏飲組1組大鼠在飼養(yǎng)到16月時灌胃何首烏飲60d,何首烏飲2組在飼養(yǎng)到1

2、7月時灌胃何首烏飲30d;何首烏丸組在飼養(yǎng)到16月時灌胃何首烏丸60d。
　　2.樣本的收集
　　大鼠稱重后,水合氯醛麻醉,內眥眶后靜脈叢取血2 ml,離心后取上清液用于檢測血清睪酮的濃度。酒精消毒,取附睪尾部,用生理鹽水漂洗2次,剪3刀,置于盛有1 ml37℃生理鹽水凍存管中,37℃水浴箱中孵育30 min,檢測精子質量。取睪丸,稱量,計算睪丸指數。
　　3.觀察指標
　　3.1.血清睪酮濃度測定:采用生物化學

3、發(fā)光法檢測各組大鼠血清睪酮的濃度。
　　3.2.大鼠睪丸指數的計算:睪丸指數=睪丸濕重/體重×100％。
　　3.3.光鏡觀察:睪丸組織采用常規(guī)處理,HE染色,觀察睪丸組織形態(tài)學變化。
　　3.4.精子質膜完整性觀察:采用乙酰乙酸鹽+碘化丙啶染色法,從凍存管中取出新收集的精子懸液,離心后去上清,PBS洗滌2次,調整精子濃度至5×106/ml,加入乙酰乙酸鹽染液使其終濃度至20μg/mL,37℃避光染色3 min,然后加

4、入碘化丙啶染液使其終濃度至5μg/mL,染色3 min,涂片后用熒光顯微鏡計數200個精子(頭部綠色熒光的為質膜完整的精子,紅色熒光為質膜破損的精子),計算頭部綠色熒光的精子的百分數。
　　3.5.精子線粒體功能檢測:從凍存管中取出新收集的精子懸液離心后去上清,PBS洗滌2次,離心去上清,加入100μl20μg/ml的羅丹明123,37℃避光染色30 min,用0.1 M PBS調至精子濃度至5×106/ml,熒光顯微鏡下觀察,發(fā)

5、綠色熒光的精子線粒體功能正常,而發(fā)弱熒光或熒光出現分節(jié)現象說明線粒體功能減弱。計數200個精子,計算發(fā)綠色熒光精子的百分數。
　　3.6.精子DNA完整性檢測:采用精子DNA吖啶橙熒光檢測試劑盒檢測精子DNA完整性。從凍存管中取出新收集的精子懸液放入EP管中,離心去上清,加入1 ml清潔液 A洗滌2次,離心去上清,調精子濃度至5×106/ml,涂片,晾干后加入200μl固定液B,室溫固定2h,滴加染色液 C,室溫避光染色5min,

6、然后用清潔液 A沖洗2～3次,熒光顯微鏡觀察,頭部發(fā)綠色熒光的為 DNA正常精子,發(fā)紅色或黃色熒光的DNA異常精子。計數200個精子中頭部發(fā)綠色熒光的精子百分數。
　　結果:
　　1.自然衰老組血清睪酮含量明顯低于青年對照組(P<0.01),何首烏飲1、2組和何首烏丸組均能不同程度提高睪酮的濃度,與自然衰老組比較,顯著升高(P<0.05),且何首烏飲1組睪酮濃度升高最為顯著。
　　2.自然衰老組大鼠睪丸指數比青年對照組

7、顯著下降(P<0.01);何首烏飲1、2組和何首烏丸組睪丸指數比自然衰老組大鼠顯著增加,何首烏飲1組療效最佳。
　　3.青年對照組,睪丸生精小管邊界整齊,無萎縮及塌陷,界膜完整,無增厚及纖維化;管腔內可見排列整齊的各級生精細胞和支持細胞,管腔內可見精子。自然衰老組,睪丸生精小管基膜部分增厚,邊界不完整,有萎縮和塌陷,生精細胞層數明顯減少,細胞稀疏;何首烏飲和何首烏丸干預后大鼠睪丸生精小管的形態(tài)結構明顯改善,基膜趨于完整,生精上皮細

8、胞層數增多,何首烏飲1組明顯好于其他各組。
　　4.質膜完整性檢測結果顯示:自然衰老組大鼠發(fā)綠色熒光的精子數量比青年對照組顯著下降(P<0.01);而何首烏飲1、2組和何首烏丸組發(fā)綠色熒光的精子數比自然衰老組大鼠顯著增多,且何首烏飲1組療效好于其余各組。
　　5.精子線粒體功能檢測結果顯示:自然衰老組大鼠發(fā)綠色熒光精子數量比青年對照組顯著下降(P<0.01);而何首烏飲1、2組和何首烏丸組發(fā)綠色熒光的精子比自然衰老組大鼠顯著

9、增多,且何首烏飲1組療效最佳。
　　6.精子DNA完整性檢測結果顯示:自然衰老組大鼠頭部發(fā)綠色熒光精子數量明顯減少,發(fā)紅色或黃色熒光的DNA異常精子顯著增多,與青年對照組比較有顯著性差異(P<0.01);而何首烏飲和何首烏丸組頭部發(fā)綠色熒光的精子比自然衰老組大鼠顯著增多,且何首烏飲1組頭部發(fā)綠色熒光的精子明顯多于其余各組。
　　結論:何首烏飲能夠提高衰老大鼠血清睪酮的濃度,改善睪丸組織形態(tài)結構,提高睪丸指數,具有明顯提高精子