shRNA沉默Annexin A2基因?qū)θ朔蜗侔┘毎鸄549生物學行為的影響.pdf

1、背景與目的:肺癌是世界上發(fā)病率較高、治療效果相對較差的惡性腫瘤，并已成為絕大多數(shù)國家癌癥死亡的首要原因。惡性增殖和侵襲轉(zhuǎn)移是肺癌惡性表型的最本質(zhì)表現(xiàn)，是影響生存率和病死率的主要因素。膜聯(lián)蛋白A2(AnnexinA2)是一類鈣依賴性磷脂結(jié)合蛋白，具有多種重要的生物學功能，與多種疾病的發(fā)生有關。已有研究顯示AnnexinA2參與腫瘤細胞的DNA合成和侵襲轉(zhuǎn)移，與大多數(shù)腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關。我們在人支氣管上皮癌變各階段組織、肺鱗癌及癌旁組織的比

2、較蛋白質(zhì)組學、肺癌血清蛋白質(zhì)組學的前期研究中發(fā)現(xiàn)AnnexinA2在癌組織中高表達，且具有抗原性，但其機制不明。為進一步探討AnnexinA2與肺癌之間的關系，本課題應用RNA干擾(RNAinterference，RNAi)技術研究AnnexinA2基因沉默對人肺腺癌細胞A549生物學行為的影響，為進一步闡明AnnexinA2在肺癌惡性進展中的分子機制、尋找預防及治療肺癌侵襲轉(zhuǎn)移的潛在靶標提供實驗依據(jù)。
　　 方法:(1)以人肺

3、腺癌A549細胞株為研究對象，體外構建AnnexinA2序列特異性雙鏈短發(fā)卡RNA(shorthairpinRNA，shRNA)質(zhì)粒，脂質(zhì)體介導轉(zhuǎn)染A549細胞，同時設無關序列組、空載體組、空白組為對照組，于轉(zhuǎn)染后24小時熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率和轉(zhuǎn)染后48小時收集shRNA質(zhì)粒干擾細胞。(2)采用半定量RT-PCR方法檢測各組細胞AnnexinA2mRNA的表達。(3)用Westernblot和免疫細胞化學方法檢測各組細胞Annexin

4、A2蛋白質(zhì)表達。(4)通過MTT法測定各組細胞增殖能力。(5)用TransweⅡ小室模型檢測各組細胞體外侵襲能力。(6)利用ELISA方法檢測各組培養(yǎng)細胞上清中基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrixmetalloproteinase-2，MMP-2)和組織蛋白酶B(cathepsinB，CB)的濃度。
　　 結(jié)果:(1)AnnexinA2shRNA質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染人肺腺癌A549細胞，轉(zhuǎn)染效率達60％。(2)轉(zhuǎn)染48小時后，shRNA轉(zhuǎn)染

5、組AnnexinA2的mRNA及蛋白質(zhì)表達水平均明顯下調(diào)(p<0.05)、(p<0.05)，細胞增殖活性顯著降低(p<0.05)，細胞的體外侵襲能力明顯減弱(p<0.05)，其培養(yǎng)上清中MMP-2和CB的濃度顯著減少(p<0.05)、(p<0.05)。
　　 結(jié)論:(1)采用RNA干擾技術能有效降解AnnexinA2mRNA，抑制其蛋白的表達，顯著降低人肺癌細胞增殖、體外侵襲能力。(2)AnnexinA2基因表達的下調(diào)能引起下游