影響人早期胚胎發(fā)育的卵丘細胞中mRNA-lncRNA表達譜的研究.pdf

1、第一部分影響早期胚胎發(fā)育的卵丘細胞中mRNA表達譜的研究
　　【目的】本實驗采用Arraystar human mRNA表達譜芯片技術檢測人MⅡ卵母細胞周圍卵丘細胞中對影響早期胚胎發(fā)育的 mRNAs表達水平，并對差異表達的mRNAs進行篩選分析和驗證。
　　【方法】
　　1.收集在我中心接受IVF-ET治療的患者的卵丘細胞，按照胚胎質量各自對應分組，發(fā)育成優(yōu)質胚胎的卵母細胞周圍的卵丘細胞為優(yōu)質胚胎卵丘細胞組（A組）,發(fā)

2、育成劣質胚胎的卵母細胞周圍的卵丘細胞為劣質胚胎卵丘細胞組（B組）。檢測6個樣本的RNA總量以保證符合芯片檢測要求。對卵丘細胞樣本中RNA通過逆轉錄獲得Cy3熒光染料標記的aRNA，采用Arraystar Human mRNA V2.0表達譜芯片（8x60K，Arraystar）檢測卵丘細胞樣本中mRNA表達水平，Agilent Feature Extraction(version11.0.1.1)軟件提取獲得的微陣列圖像原始信號值，Ge

3、neSpring GX verision12.1軟件包(Agilent Technologies)對獲取的mRNA原始信號值進行標準化處理并質量評估。
　　2.采用兩分類的差異基因篩選方法對差異mRNAs進行篩選，火山圖和聚類分析圖顯示兩組卵丘細胞中差異mRNAs表達情況。應用基因富集分析方法進一步分析差異表達的mRNAs，分別進行GO分析和KEGG pathway分析。
　　3.差異mRNAs的Real-time PCR驗

4、證篩選相關的mRNAs，挑選目的基因，采用實時定量PCR驗證其表達水平。
　　【結果】
　　1.對接受IVF-ET治療患者中，選取的3例患者6個樣本的卵丘細胞經檢測均符合mRNA表達譜芯片檢測的要求。其中，A組樣本（4A、5A、7A）中RNA OD260/280比值分別為1.95、1.92、2.04；B組樣本（4B、5B、7B）中RNA OD260/280比值分別為2.05、2.00、1.94。兩組樣本符合芯片檢測實驗要求。

5、對卵丘細胞樣本中RNA進行反轉錄并用Cy3熒光染料進行標記，特異性標記活性為（pmol/μl染料）/(μg/μl cRNA），A組（4A、5A、7A）分別為21.42、21.70、20.64，B組（4B、5B、7B）分別為21.25、21.47、21.00，符合芯片檢測實驗要求。兩組樣本中共檢測到mRNA靶基因數15797個；過濾后數據質量評估，用箱體圖分析顯示6個樣本mRNAs表達水平接近在一個水平。散點圖分析結果顯示兩組卵丘細胞中存

6、在大量差異表達的mRNAs。
　　2.兩樣本間差異表達mRNAs的篩選分析，檢測到差異表達的mRNAs810個，其中B組vs A組上調表達的mRNAs是91個，B組vs A組下調表達的mRNAs是719個。對差異表達的mRNAs進行GO分析，結果顯示，B組vs A組上調表達的mRNA中，參與生物學過程的基因數是112個，參與細胞組成的基因數是24個，參與分子功能的基因數是22個。在B組vs A組下調表達的mRNA中，參與生物學過程

7、的基因數是389個，參與細胞組成的基因數是94個，參與分子功能的基因數是85個。對差異表達的mRNAs信號通路分析，結果顯示，B組vs A組上調表達的mRNA基因參與了5條信號通路，下調表達的mRNA基因參與了12條信號通路。
　　3.挑選差異基因RT-PCR驗證結果進行實時熒光定量PCR驗證，結果與芯片表達結果一致。
　　【結論】
　　發(fā)育成不同質量卵裂期胚胎的人 MⅡ期卵母細胞周圍的卵丘細胞間存在大量差異表達的 m

8、RNAs；GO分析和pathway分析提示卵丘細胞中這些差異表達的mRNAs參與了各種生物學途徑和信號通路對早期胚胎發(fā)育的調控。這些 mRNAs的表達上調或下調，可能進一步導致蛋白質的表達變化，從而影響卵母細胞的發(fā)育和早期胚胎的發(fā)育。
　　第二部分影響早期胚胎發(fā)育的卵丘細胞中l(wèi)ncRNA表達譜的研究及其與 mRNA關聯分析
　　【目的】本實驗采用Arraystar human lncRNA表達譜芯片技術檢測人MⅡ卵母細胞周圍

9、卵丘細胞中對影響早期胚胎發(fā)育的 lncRNAs表達水平，對差異表達的lncRNAs進行篩選分析和驗證。并將差異表達的lncRNAs與mRNAs關聯分析。
　　【方法】
　　1.收集在我中心接受IVF-ET治療的3名患者的卵丘細胞，按照胚胎質量各自對應分組，發(fā)育成優(yōu)質胚胎的卵母細胞周圍的卵丘細胞為優(yōu)質胚胎卵丘細胞組（A組）,發(fā)育成劣質胚胎的卵母細胞周圍的卵丘細胞為劣質胚胎卵丘細胞組（B組）。檢測6個樣本的RNA總量以保證符合芯

10、片檢測要求。對卵丘細胞樣本中RNA通過逆轉錄獲得Cy3熒光染料標記的aRNA，采用Arraystar Human lncRNA V2.0表達譜芯片（8x60K，Arraystar）檢測卵丘細胞樣本中l(wèi)ncRNA表達水平，Agilent Feature Extraction(version11.0.1.1)軟件對獲得的微陣列圖像提取原始信號值，GeneSpring GX軟件包(Agilent Technologies，verision12

11、.1)對獲取的lncRNA原始信號值進行標準化處理并質量評估。
　　2.采用兩分類的差異基因篩選方法對差異 lncRNAs進行篩選，火山圖和聚類分析圖顯示兩組卵丘細胞中差異lncRNAs表達情況。根據lncRNA在染色體上的位置和已知功能分類對芯片檢測出來的差異表達 lncRNA進行分類和亞組分析。
　　3.篩選相關的lncRNAs，挑選目的lncRNAs，采用實時定量PCR驗證其表達水平。根據芯片數據比較差異mRNAs和l

12、ncRNAs，試圖尋找出共同表達上調或者下調的基因。以與卵丘細胞、早期胚胎發(fā)育密切相關為基礎，對于 PCR結果與芯片結果一致的mRNAs和lncRNAs，分別采用CNC網絡圖分析，建立二者之間的聯系，并初步構建lncRNA與mRNA的調控網絡。
　　【結果】
　　1.對接受IVF-ET治療患者中，選取的3例患者6個樣本的卵丘細胞經檢測均符合 lncRNA表達譜芯片檢測的要求。其中，A組樣本（4A、5A、7A）中RNA OD2

13、60/280比值分別為1.95、1.92、2.04；B組樣本（4B、5B、7B）中RNA OD260/280比值分別為2.05、2.00、1.94。兩組樣本符合芯片檢測實驗要求。對卵丘細胞樣本中RNA逆轉錄并用Cy3熒光染料進行標記，特異性標記活性為（pmol/μl染料）/(μg/μl cRNA），A組（4A、5A、7A）分別為21.42、21.70、20.64，B組（4B、5B、7B）分別為21.25、21.47、21.00，符合芯片

14、檢測實驗要求。兩組樣本中共檢測到lncRNA20563個；過濾后數據質量評估，用箱體圖分析顯示6個樣本的lncRNAs表達水平接近在一個水平。散點圖分析結果顯示兩組卵丘細胞中存在大量差異表達的lncRNAs。
　　2.兩樣本間差異表達lncRNAs的篩選分析，檢測到差異表達的lncRNAs共633個，其中B組vs A組上調表達的lncRNAs是124個，B組vs A組下調表達的lncRNAs是509個。對lncRNA亞組分析：發(fā)揮

15、增強子功能的lncRNAs有925個，增強子附近編碼基因的有166個；HOX簇序列的lncRANs有387個；位于基因間的 lncRNA(LincRNAs)有2041個，LincRNAs附近的編碼基因有373個。
　　3.部分差異lncRNAs進行實時熒光定量PCR驗證，結果與芯片表達結果一致。根據芯片數據，篩選比較了差異mRNAs和lncRNAs，篩選出共同表達的基因分別為：ASNS、CALB2和NEK7，對應的 lncRNAs

16、分別為：ENST00000429197、NR_027910和Y00062。三對mRNAs/lncRNAs在B組vs A組中均是下調表達。
　　【結論】
　　1.發(fā)育成不同質量卵裂期胚胎的人MⅡ期卵母細胞周圍的卵丘細胞間存在大量差異表達的lncRNAs，提示了卵丘細胞中這些差異表達的lncRNAs可能參與了對早期胚胎發(fā)育的調控機制；對lncRNAs的亞組分析提示有很多不同功能的lncRNAs參與mRNAs的轉錄水平的調節(jié)、表觀