Vasohibin-1在腎細胞癌中的表達及其生物學(xué)作用的初步研究.pdf

1、目的:研究探討Vasohibin-1(VASH1)在腎細胞癌組織中的表達特性及其與缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)，微血管密度(MVD，CD34標記)以及腎細胞癌臨床病理特征之間的關(guān)聯(lián)性;研究VASH1對人臍靜脈血內(nèi)皮細胞(HUVEC)增殖、細胞周期、凋亡，以及對腎細胞癌細胞(786-0)增殖、細胞周期、凋亡、侵襲能力等一系列細胞生物學(xué)行為方面的影響，初步探討VASH1的生物學(xué)作用，以期能夠為腎細胞癌找到新的分子標志物和抗腫瘤血管生成

2、有效的治療靶點奠定理論基礎(chǔ)。
　　方法:(1)免疫組織化學(xué)染色法對46例腎細胞癌組織和20例癌旁正常腎組織中的VASH1、HIF-1α以及MVD(CD34標記)進行檢測，分析其在腎細胞癌中表達的相關(guān)性及其與臨床病理參數(shù)之間存在的關(guān)聯(lián);(2)利用真核表達載體pReceiver-M61和含VASH1cDNA的質(zhì)粒T7-VASH1通過基因重組技術(shù)構(gòu)建pReceiver-M61-VASH1，酶切以及測序鑒定重組質(zhì)粒;利用含VASH1cDN

3、A的質(zhì)粒T7-VASH1、GV287慢病毒系列載體、pHelper1.0載體和pHelper2.0載體三質(zhì)粒組成的慢病毒載體系統(tǒng)來獲得過表達VASH1的慢病毒顆粒，PCR以及測序鑒定重組質(zhì)粒，定量PCR檢測病毒滴度;(3)將pReceiver-M61-VASH1轉(zhuǎn)染HUVEC以及786-0細胞，應(yīng)用MTT法、流式細胞儀以及Transwell小室研究探討過表達VASH1對HUVEC細胞增殖、細胞周期、凋亡以及對786-0細胞增殖、細胞周期

4、、凋亡、侵襲能力的影響。
　　結(jié)果:(1)在癌旁正常腎組織中，VASH1主要表達于腎小管上皮細胞，部分表達于血管內(nèi)皮細胞以及腎小球系膜細胞;在腎細胞癌組織中，VASH1主要表達于腫瘤細胞的細胞質(zhì)以及細胞膜，部分表達于血管內(nèi)皮細胞的細胞質(zhì)以及細胞膜;VASH1在癌旁正常腎組織中的表達強度顯著高于腎細胞癌組織(P＜0.05)，VASH1的表達在不同組織學(xué)類型，不同臨床分期的腎細胞癌中差異有統(tǒng)計學(xué)意義，隨著腫瘤惡性程度的增加其表達強度呈

5、下降趨勢(P＜0.05);VASH1，HIF-1α及MVD在腎細胞癌組織中表達的相互關(guān)系顯示，VASH1與HIF-1α具有顯著負相關(guān)性(P＜0.05)，VASH1與MVD具有顯著負相關(guān)性(P＜0.05)，HIF-1α與MVD具有顯著正相關(guān)性(P＜0.05)。(2)重組pReceiver-M61-VASH1經(jīng)過酶切以及測序鑒定證實VASH1cDNA片段正確地插入真核表達載體pReceiver-M61中;重組GV287-VASH1經(jīng)PCR以

6、及測序鑒定證實VASH1cDNA片段正確地插入慢病毒表達載體GV287中，包裝、純化、濃縮后的慢病毒濃縮液經(jīng)定量PCR檢測后證實得到病毒滴度為2.00E+8TU/ml的重組慢病毒顆粒。(3)Western blot結(jié)果顯示pReceiver-M61-VASH1轉(zhuǎn)染HUVEC以及786-0細胞后，與正常細胞組和對照組相比，過表達組HUVEC和786-0細胞中VASH1蛋白的表達量明顯增多(P＜0.05);MTT結(jié)果顯示pReceiver-

7、M61-VASH1真核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HUVEC以及786-0細胞48小時后，與正常細胞和對照相比，過表達VASH1的HUVEC和786-0細胞的OD值均顯著降低(P＜0.05）;流式細胞術(shù)結(jié)果顯示pReceiver-M61-VASH1真核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HUVEC以及786-0細胞48小時后，與正常細胞和對照相比，過表達VASH1的HUVEC和786-0細胞的G0/G1期細胞比例均增多，S期細胞比例均減少，細胞周期均阻滯于G0/G1期(P＜0

8、.05）;流式細胞術(shù)結(jié)果顯示pReceiver-M61-VASH1真核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HUVEC以及786-0細胞48小時后，與正常細胞和對照相比，過表達VASH1的HUVEC和786-0細胞的凋亡比率均顯著增加(P＜0.05);Transwell小室檢測pReceiver-M61-VASH1真核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染786-0細胞48小時后，過表達VASH1的786-0細胞與正常細胞和對照相比，穿過濾膜的細胞數(shù)未表現(xiàn)出顯著性差異（P＞0.05）。<

9、br>　　結(jié)論:(1)VASH1在腎細胞癌中并非只由血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生，其也可由其他細胞產(chǎn)生;VASH1在腎細胞癌中的表達與HIF-1α，MVD以及臨床病理特征存在一定相關(guān)性，其隨著腫瘤惡性程度的增加其表達強度呈下降趨勢。(2)含VASH1cDNA的重組質(zhì)粒pReceiver-M61-VASH1在體外能夠有效地促進VASH1蛋白在HUVEC中的表達。HUVEC過表達VASH1后可以有效地抑制HUVEC細胞在體外的增殖，使HUVEC細胞周期

10、阻滯于G0/G1期以及誘導(dǎo)HUVEC發(fā)生細胞凋亡。(3)含VASH1cDNA的重組質(zhì)粒pReceiver-M61-VASH1在體外能夠有效地促進VASH1蛋白在786-0細胞中的表達。786-0細胞過表達VASH1后可以有效地抑制786-0細胞在體外的增殖，使786-0細胞的細胞周期阻滯于G0/G1期以及誘導(dǎo)786-0細胞發(fā)生細胞凋亡。(4)VASH1在腎細胞癌組織中的低表達可能參與了腎細胞癌血管生成的發(fā)生、發(fā)展，VASH1有望成為腎細