復(fù)發(fā)性流產(chǎn)絨毛組織中細(xì)胞凋亡信號通路的研究.pdf

1、目的:復(fù)發(fā)性流產(chǎn)是一種病因復(fù)雜并嚴(yán)重危害家庭幸福的疾病。細(xì)胞凋亡是自然流產(chǎn)的發(fā)生基礎(chǔ)。復(fù)發(fā)性流產(chǎn)病因復(fù)雜，主要包括遺傳缺陷、解剖異常、內(nèi)分泌紊亂、免疫因素、感染、血栓及環(huán)境因素等。但目前超過50％以上的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者不能找到明確病因。TP53可誘導(dǎo)細(xì)胞生長阻滯，細(xì)胞凋亡，細(xì)胞分化以及DNA修復(fù)。TP53基因的各種功能主要是通過激活或抑制其下游基因來完成的。TP53蛋白介導(dǎo)其下游基因CDKN1A和BAX是與凋亡相關(guān)的重要信號通路。TP53

2、可介導(dǎo)下游效應(yīng)蛋白CDKN1A的表達(dá)，將細(xì)胞阻斷于G1期，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。而BAX具有促凋亡的作用，其在TP53的激活下直接啟動線粒體相關(guān)的凋亡通路。因此本研究以人正常早期妊娠及不明原因自然流產(chǎn)的絨毛組織標(biāo)本為對象，檢測絨毛組織細(xì)胞凋亡情況及調(diào)節(jié)基因TP53和其下游基因CDKN1A、BAX的表達(dá)，以探討細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白TP53及其下游基因CDKN1A、BAX在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)發(fā)病機(jī)制中的作用。
　　方法:選取有復(fù)發(fā)性流產(chǎn)史患者為實(shí)驗(yàn)組，

3、共30例，選取有正常生育史婦女為對照組，共30例。所有入選患者尿液中HCG均呈陽性。入選者均通過負(fù)壓吸引術(shù)獲得的絨毛組織。其中一部分絨毛組織凍存于-196℃液氮中，以備PCR實(shí)驗(yàn)用。另一部分在室溫經(jīng)10％福爾馬林固定過夜后石蠟包埋，切片厚度5μm，貼于涂有APES的載玻片上，以備免疫組化及凋亡染色實(shí)驗(yàn)用。
　　1.TP53蛋白的檢測利用免疫組化的方法，以TP53特異性一抗與組織內(nèi)相關(guān)抗原結(jié)合，并通過辣根過氧化物酶處理后的即用型二抗

4、與一抗結(jié)合將抗原放大，然后借助DAB顯色劑將抗原抗體反應(yīng)部位顯示出來，在蘇木素對細(xì)胞核進(jìn)行染色后使用中性樹膠封片。每個樣品選取3個視野（200倍放大）拍照，每個視野照片都使用Photoshop CS5軟件計(jì)算灰度，然后取3個視野的平均值作為該樣品的平均灰度值。
　　2.CDKN1A、BAX mRNA相對表達(dá)量的檢測采用實(shí)時定量PCR(real-time quantitative PCR)法進(jìn)行CDKN1A和BAX mRNA相對表達(dá)

5、量的檢測。絨毛組織提取總RNA，步驟如下:液氮凍存的絨毛組織經(jīng)液氮研磨后，加入1mL Trizol混勻，取500μL懸液加入200μL氯仿混勻后12000rpm離心15min，取上層清液與等體積異丙醇混勻后12000rpm離心15min，75％乙醇洗滌沉淀后，沉淀溶解于50μLRNase-free水中。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(FastQuant RT Kit(With gDNase)，說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。按照試劑盒(SYBR(@) Premix

6、 Ex TaqTM)說明書配制反應(yīng)體系。反應(yīng)程序?yàn)?預(yù)變性:95℃，30sec; PCR擴(kuò)增:95℃，3sec;60℃，30sec;84℃，1see;40個循環(huán)，84℃讀取熒光。2-△△Ct法計(jì)算CDKN1A、BAX mRNA在絨毛組織中的相對表達(dá)量。
　　3.細(xì)胞凋亡檢測采用脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）對絨毛細(xì)胞進(jìn)行檢測，實(shí)驗(yàn)流程按照試劑盒說明書進(jìn)行操作(DeadEndTMFluorometric

7、TUNEL System)。最后使用SlowFade(@) Gold Antifade Reagentwith DAPI對樣品進(jìn)行封片。在熒光顯微鏡觀察以細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)綠色顆粒作為陽性細(xì)胞，既凋亡細(xì)胞。每個樣品選取3個視野（100倍放大），每個視野在熒光顯微鏡下用520nm波長拍照一次（綠色TUNEL），然后用430nm波長拍照一次（藍(lán)紫色DAPI），使用Photoshop CS5將兩張照片進(jìn)行合成。最后使用Image-Pro Plus6

8、.0進(jìn)行熒光分析。
　　結(jié)果:
　　1.絨毛組織中TP53蛋白的表達(dá)免疫組化結(jié)果顯示TP53蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞核中，呈黃色或者棕黃色顆粒。TP53蛋白在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者的絨毛組織中表達(dá)量顯著性高于正常絨毛組織。對正常組和實(shí)驗(yàn)組絨毛組織標(biāo)本中TP53蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行陽性評定。對照組平均灰度顯著高于實(shí)驗(yàn)組，兩組比較P=0.000，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2.絨毛組織中CDKN1A和BAX mRNA的表達(dá)結(jié)果顯

9、示與正常組的mRNA水平比較，實(shí)驗(yàn)組患者的絨毛組織中CDKN1A mRNA水平顯著性上調(diào)，兩組比較P=0.015具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。實(shí)驗(yàn)組患者的絨毛組織中BAX mRNA水平顯著性高于對照組，兩組比較P=0.019差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　3.絨毛組織的細(xì)胞凋亡TUNEL檢測顯示對照組和實(shí)驗(yàn)組患者的絨毛組織的細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞中均有凋亡細(xì)胞出現(xiàn)，但是對照組的凋亡細(xì)胞較少，實(shí)驗(yàn)組凋亡細(xì)胞較多。兩組比較P=