甘藍型油菜中可能與ATP 6相互作用的基因的克隆及真核表達載體的構建.pdf

1、細胞質雄性不育和核控制的育性恢復是廣泛存在于植物中的生理現象。細胞質雄性不育不僅是研究細胞核基因和細胞質基因相互作用的的重要材料，而且該現象在雜種優(yōu)勢的利用中有著十分重要的作用。因此，研究哪些與細胞質雄性不育有關的基因，利用基因工程的方法創(chuàng)造雄性不育系，在雜交中的生產中具有重要的意義。 甘藍型油菜是世界上廣泛種植一種重要的油料作物，其雜種優(yōu)勢比較明顯，因此把雄性不育應用于雜交種的生產具有重大的意義。目前，人們對于甘藍型油菜雄性不

2、育的研究主要集中于蘿卜胞質不育，波里馬胞質不育和nap胞質不育。波里馬細胞質雄性不育因其不育性穩(wěn)定，容易找到恢復基因，此不育系被認為在雜交中的生產中是最有優(yōu)勢的。 甘藍型油菜波利馬(Brassica napus pol．)細胞質雄性不育系因其不育性穩(wěn)定，容易找到恢復基因，被認為是一種很有實用價值的油菜胞質不育類型。目前關于其分子機制的研究已證實，線粒體ATP合成酶的一個亞基ATP 6與其雄性不育相關。 以與甘藍型油菜波里

3、馬細胞質雄性不育有關的atp 6基因編碼的ATP 6作為誘餌蛋白，通過酵母雙雜交技術，篩選與其相互作用的蛋白質，并克隆出其編碼序列。 本試驗對其中的一個篩選結果進行研究。測序結果表明，由酵母雙雜交所篩選到的序列只是基因的3’端序列，并不是基因的完整序列。在此已知片段的基礎上，我們利用cDNA末端快速擴增(RACE)的方法對基因的5'端cDNA進行擴增，測序后blast的比對結果表明，只是基因的部分序列，并沒有擴增到基因全長序列。

4、根據RACE的測序結果，設計引物，通過染色體步移的方法進行基因的克隆。測序后，將酵母雙雜交的測序結果，RACE的測序結果，以及染色體步移的測序結果進行序列拼接，根據拼接所得到的全長序列設計引物：359-Up-primer： 5'-ATG ATG GAT ACT TTC CCT CCT TCG-3'：359-Down-primer.5'-TCA CCA GAA GGG TAA CAA AAC ACA AG-3'，分別以油菜的總基因組DNA

5、和反轉的cDNA作為模板，進行基因全長的擴增，連接到pMD18-T載體。測序結果分析表明，此基因的DNA全長為1172bp，cDNA全長為1011bp，內含子長161bp，分為兩段序列，其長度分別為79bp和82bp。在NCBI上進行比對分析，此基因含有水解酶家族十七的保守結構域，該基因與擬南芥的編碼未知蛋白的基因(GeneBank登錄號為AA042272.1)同源性達88％，與擬南芥的推定的葡聚糖內切-1，3-beta-葡萄糖酶1前體

6、(GeneBank登錄號為065539)的同源性為88％。利用網站和多種生物學軟件對推導出的氨基酸序列進行分析。分析結果表明，此氨基酸序列有以下特征：(1)無信號肽序列：(2)有兩個跨膜結構域。 由于在油菜中還未見有此基因序列的報道，其在油菜中的功能也是未知的。因此對該基因進行了載體的構建。先用Pst Ⅰ/BamH Ⅰ酶切含有目標序列的T載體，連接到pBlueseript SK Ⅱ中間載體上面，再分別用EcoR V/BamH Ⅰ