Hfq對霍亂弧菌環(huán)境適應能力的影響及相關基因的轉錄調控.pdf

1、目的：構建霍亂弧菌C7258菌株的hfq基因的缺失株和缺失回補株，分析Hfq蛋白對霍亂弧菌環(huán)境適應能力的影響，驗證Hfq對環(huán)境生存及致病相關基因轉錄的調控。
　　 方法：1.PCR方法擴增霍亂弧菌C7258菌株hfq基因的上、下游片段，作為上和下游同源臂，搭橋PCR方法擴增將上、下游同源臂連接。搭橋PCR片段和自殺質粒pWM91分別進行雙酶切，之后用連接酶進行連接，獲得重組自殺質?！鱤fq-pMW91，轉化入大腸桿菌SM10λp

2、ir株。采用同源重組方法，通過結合將自殺質粒△hfq-pMW91轉入霍亂弧菌C7258菌株，利用慶大霉素和氨芐青霉素雙抗平板和pWM91質粒的sacB基因在蔗糖平板上殺死供體菌的方法構建霍亂弧菌C7258菌株的hfq基因的缺失株，并進行PCR鑒定。2.PCR方法擴增hfq基因，獲得完整的基因片段△hfq-C，將△hfq-C片段和pUC18克隆載體分別進行XbaⅠ和HidⅢ限制性內切酶雙酶切，連接酶連接2酶切產物，轉化入大腸桿菌SM10λ

3、pir菌株中，獲得重組克隆載體△hfq-C-pUC18。將△hfq-C-pUC18重組克隆載體電轉入△hfq缺失株中，獲得△hfq-C回補株，篩選陽性克隆病用PCR鑒定。3.PCR方法擴增hfq基因，獲得hfq-P片段，限制性內切酶BamH(Ⅰ)和HidⅢ分別雙酶切hfq-P片段和表達載體pET28a，將酶切產物連接，轉化入大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞中，獲得Hfq蛋白表達株hfq-P-BL21(DE3)，經IPTG誘導，進行12％SDS

4、-PAGE蛋白電泳。4.通過對野生株、突變株、回補株在富氧、缺氧、膽鹽、M9環(huán)境下的生長狀態(tài)，從初始培養(yǎng)到平臺期整個過程，每隔1小時測定D600nm，重復三次，用平均值繪成生長曲線，統計學方法比較差異;將野生株、突變株、回補株點在Swim平板上，30℃培養(yǎng)24小時，觀察細菌的游動能力，光學顯微鏡觀察野生株、突變株、回補株菌落的透明度及褶皺程度，對野生株、突變株、回補株培養(yǎng)24小時進行結晶紫染色，并測定D570nm;野生株和突變株對不同濃

5、度的去污劑SDS及慶大霉素的抗性能力比較及應對H2O2刺激的敏感性測定，從而比較霍亂弧菌野生株和Hfq突變株在營養(yǎng)受限條件下細菌的生長狀況，細菌的運動能力、生物膜形成、外膜抗性和氧化應激能力上的差異。5.針對霍亂弧菌△hfq缺失株表型實驗結果，推測可能的相關調控基因，并提取霍亂弧菌野生株和缺失株的RNA，應用熒光定量PCR(RT-qPCR)技術對Hfq可能調控的相關基因的轉錄水平進行比較，靶基因涉及鞭毛合成，胞外多糖合成，外膜蛋白，整體

6、調控子以及氧化應激相關。
　　 結果：1.通過基因敲除-同源重組技術成功構建了霍亂弧菌C7258菌株的△hfq缺株。2.通過融合PCR技術和電轉化技術成功構建了霍亂弧菌△hfq缺失株的△hfq-C/△hfq回補株。3.通過融合PCR技術和鈣轉化技術成功構建了大腸桿菌hfq-P-BL21(DE3)-DH5αλpir蛋白表達株。4.Hfq蛋白激活與鞭毛合成及功能相關基因fliA，flaA，flaC，motA，motX轉錄從而增強霍亂

7、弧菌的游動能力;但Hfq蛋白不調控galU和galE的轉錄，提示Hfq蛋白不影響霍亂弧菌的脂多糖結構;Hfq蛋白抑制胞外多糖的合成基因vpsT和vpsA轉錄，同時抑制VPS合成的轉錄調節(jié)子vpsR轉錄，達到抑制生物膜形成的作用。5.Hfq蛋白激活外膜蛋白OmpU和OmpT轉錄，起到提高外膜抗性能力。6.Hfq蛋白抑制katE和sodC的轉錄，激活phoB和katG的轉錄，相對作用的最終結果是Hfq蛋白提高抵御氧化應激的能力。7.Hfq蛋