心臟微血管內(nèi)皮細胞在病毒性心臟病心肌纖維化中的作用及其機制.pdf

1、病毒性心肌炎(viral myocarditis，VMC)是心肌局限性或彌漫性的急性或慢性炎性病變。絕大多數(shù)患者預(yù)后良好;約10～15％的患者由于急性期后炎癥持續(xù)、病情遷延反復(fù)，進展為擴張型心肌病(dilated cardiomyopathy, DCM)。在原發(fā)性擴張型心肌病中，高達60％的患者能檢測到病毒的感染。表明病毒感染是心肌炎心肌病重要的觸發(fā)因素之一。
　　心肌纖維化貫穿于VMC和DCM的各個階段，纖維化程度的高低與疾病的

2、預(yù)后和對藥物的反應(yīng)密切相關(guān)。心肌成纖維細胞活化是心肌纖維化最主要的始動因素。既往研究認為器官中的成纖維細胞絕大多數(shù)依靠組織中存在的固有成纖維細胞增生、活化;近年來不斷有研究證實，內(nèi)皮細胞在某些病理狀態(tài)下，也能夠借由內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(endothelial to mesenchymal transition，Endo-MT)轉(zhuǎn)化為分泌細胞外基質(zhì)的肌成纖維細胞，促進纖維化的發(fā)展。Endo-MT指的是在病理狀態(tài)下，內(nèi)皮細胞在細胞因子的作用下向間質(zhì)

3、細胞轉(zhuǎn)化，其表型和功能均發(fā)生明顯改變;即內(nèi)皮細胞特異性的蛋白如血管鈣粘蛋白(vascular endothelial cadherin，VE-cadherin)和血管內(nèi)皮粘附分子1/CD31(platelet-endothelial cell adhesionmolecular-1/CD31)表達減弱甚至消失;而間質(zhì)細胞特異性的標志物如α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)和成纖維細胞特異性蛋白1（

4、fibroblast-specific protein-1，F(xiàn)SP1）表達增多，脫離微血管腔面、遷移進入組織，并獲得分泌膠原蛋白的能力。
　　多種病毒可引起心肌炎，尤以腸道病毒中的柯薩奇病毒B3(CoxsackievirusB3，CVB3)最為常見。CVB3主要經(jīng)呼吸道及消化道傳播疾病，其感染具有特殊性，需要兩次穿越內(nèi)皮細胞至靶器官。病毒通過消化道及呼吸道粘膜內(nèi)皮細胞進入外周血;之后病毒隨血流進入冠脈微血管，穿越心臟微血管內(nèi)皮細胞

5、、感染心肌細胞。因而心臟微血管內(nèi)皮細胞對于病毒的嗜心性具有重要的選擇及保護作用;心臟微血管內(nèi)皮細胞是排列在心臟冠脈微血管內(nèi)的單層細胞層，是心肌細胞最重要和最后的一層保護屏障。在病理狀態(tài)下，心臟微血管內(nèi)皮還能分泌眾多細胞因子，維持心臟微環(huán)境的平衡穩(wěn)定。
　　既往我們關(guān)于病毒性心臟病的研究主要集中于病毒感染心肌細胞后引起的病理生理變化，忽略了心臟微血管內(nèi)皮細胞在病毒感染所致的心臟損傷中的作用。作為心肌細胞最后和最重要的一層保護屏障，本

6、研究在臨床DCM患者中發(fā)現(xiàn)Endo-MT對心肌纖維化的潛在作用的基礎(chǔ)上，鑒于病毒感染是心臟擴大重要的觸發(fā)因素，我們圍繞著CVB3感染如何通過損傷心臟微血管內(nèi)皮細胞，從而促進了心肌損傷及心肌纖維化，以及病毒感染引起的內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在心肌炎心肌纖維化中的作用及可能的分子機制展開研究。
　　第一部分:內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在擴張型心肌病心肌重構(gòu)中的作用
　　[目的]：擴張型心肌病以左室增大和心肌纖維化為特點。有報道表明內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(endot

7、helial-to-mesenchymal transition，Endo-MT)參與動物模型中器官纖維化的形成。本研究致力于闡明Endo-MT是否參與了DCM心肌纖維化的進程。
　　[方法]：在40名DCM心臟移植患者的廢棄心肌組織和正常對照組心肌組織中采用免疫組化檢測內(nèi)皮細胞標志物(CD31 and VE-cadherin)和成纖維細胞標志物(α-SMA and FSP1)，并將此與患者的臨床資料特點進行分析。使用共聚焦檢測內(nèi)

8、皮細胞和成纖維細胞標志物共定位情況。免疫印跡法檢測Wnt、β-catenin和snail的蛋白水平。
　　[結(jié)果]：與正常對照心肌相比，患者病變心肌內(nèi)皮細胞標志物(CD31，P＜0.01;VE-cadherin, P＜0.01)明顯減少，而成纖維細胞標志物(α-SMA，P＜0.01;VE-cadherin，P＜0.01)上升明顯。內(nèi)皮細胞標志物與患者左室舒張末期內(nèi)徑呈現(xiàn)明顯的負相關(guān)(CD31，r=-0.82，P＜0.01;VE-c

9、adherin，r=-0.73，P＜0.01);而成纖維細胞標志物呈現(xiàn)中度正相關(guān)(α-SMA，r=0.65，P＜0.01;FSP1，r=0.53，P＜0.01)。免疫印跡顯示經(jīng)典Wnt信號通路和snail蛋白水平均在病變心肌組織中升高明顯(P＜0.01)。
　　[結(jié)論]：本研究在患者DCM樣本中發(fā)現(xiàn)Endo-MT有可能為DCM心肌纖維化的潛在機制之一，其與DCM心室重塑具有相關(guān)性。Endo-MT的發(fā)現(xiàn)及其可能的對抗因子的出現(xiàn)為DC

10、M治療提供了一個新的靶點。
　　第二部分柯薩奇病毒感染致心臟微血管內(nèi)皮細胞功能損害及對心肌炎心肌纖維化的影響
　　[目的]：柯薩奇病毒(Coxsackievirus B3，CVB3)感染是病毒性心肌炎最常見的病原。CVB3病毒感染具有特殊性，需要兩次穿越血管內(nèi)皮至靶細胞;心臟微血管內(nèi)皮細胞正是病毒感染最重要和最后一層屏障，對病毒的嗜心性具有重要的選擇和保護作用。目前對CVB3病毒感染心臟微血管內(nèi)皮細胞研究較少。本研究探討CV

11、B3病毒對心臟微血管內(nèi)皮細胞的易感性及隨之而來的生物學改變，并觀察其在病毒性心肌炎心肌纖維化中可能的作用。體外微血管內(nèi)皮細胞通透性實驗和電鏡證據(jù)均表明感染病毒后微血管內(nèi)皮細胞的屏障功能受到破壞。
　　[方法和結(jié)果]：qPCR法檢測感染病毒后CMVECs中病毒RNA的變化，發(fā)現(xiàn)從day0-day7，細胞內(nèi)CVB3的RNA持續(xù)性表達升高，這種病毒復(fù)制在48-72小時內(nèi)達到高峰(P＜0.01);TCID法檢測上清中的病毒滴度，顯示從感染

12、開始至感染后第7天，上清中的病毒滴度始終波動于10-4～10-6;說明CMVECs是CVB3病毒的易感細胞，病毒RNA在CMVECs中能持續(xù)性復(fù)制，CMVECs在感染病毒后具有持續(xù)性釋放病毒的能力。采用流式檢測caspase3的活性，顯示病毒感染后第7天caspase3活性明顯上升(P＜0.01);病毒感染后Bax/Bcl-2的比值隨著感染時間的延長而逐漸增高，表明CVB3病毒能夠?qū)е翪MVECs增殖減低、凋亡增加。免疫印跡顯示感染病毒

13、后CMVECs持續(xù)性上升表達TGF-β1;使心臟微血管內(nèi)皮細胞發(fā)生Endo-MT轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨某衫w維細胞，并誘導(dǎo)鄰近的心肌細胞分泌細胞因子，導(dǎo)致正常心肌結(jié)構(gòu)的破壞和異常細胞外間質(zhì)沉積，從而促進心肌炎后心室重塑。
　　[結(jié)論]：本部分研究表明心臟微血管內(nèi)皮細胞也是CVB3病毒重要的宿主細胞之一;并能夠誘導(dǎo)眾多的生物學改變，有可能在急慢性病毒性心肌炎的心肌損傷和心肌纖維化中發(fā)揮了重要的作用。
　　第三部分:內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在病毒性心肌

14、炎心肌纖維化中的作用及其調(diào)控因子
　　[目的]：心肌纖維化貫穿于病毒性心肌炎各個階段，其程度與心肌炎的病程與預(yù)后密切相關(guān)。心臟成纖維細胞是心肌組織中分泌細胞外基質(zhì)的主要細胞，既往認為其主要來源于心臟固有成纖維細胞。近年來報道內(nèi)皮細胞在損傷刺激下可以通過Endo-MT轉(zhuǎn)化為活化的成纖維細胞，參與心肌重塑。本部分就病毒感染引起的內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在心肌炎心肌纖維化中的作用展開研究，并尋找可能的調(diào)控因子。
　　[方法]：建立小鼠病毒性心

15、肌炎模型。采用小鼠超聲心動圖檢測心功能;HE和天狼猩紅染色觀察心肌炎癥和膠原沉積;共聚焦檢測小鼠心肌中內(nèi)皮細胞和成纖維細胞標志物的共定位情況;免疫印跡和細胞雙免疫熒光半定量心臟微血管內(nèi)皮細胞和成纖維細胞標志物的表達;qPCR法定量細胞中轉(zhuǎn)錄因子的RNA含量。
　　[結(jié)果]：病毒感染14天后，小鼠超聲心動圖檢測發(fā)現(xiàn)心肌炎組小鼠心室腔增大、心室EF值降低。HE和SR染色顯示心肌炎組小鼠心肌炎癥細胞浸潤、出現(xiàn)灶性壞死，肌纖維排列不規(guī)則、

16、膠原沉積。共聚焦顯示心肌炎小鼠心肌中存在內(nèi)皮細胞和成纖維細胞標志物共定位，即存在Endo-MT;而這種共定位在對照組小鼠中缺失。將SB431542加入培養(yǎng)的心臟微血管內(nèi)皮細胞，發(fā)現(xiàn)SB431542能夠減弱病毒感染引起的Endo-MT，并能使轉(zhuǎn)錄因子Snail、Slug基因表達下降;SB4315421是TGF-β1特異性抑制劑，表明感染病毒后心臟微血管內(nèi)皮細胞發(fā)生的Endo-MT是由其自身分泌的TGF-β1介導(dǎo)。
　　[結(jié)論]：本研

17、究在病毒性心肌炎模型小鼠中驗證了Endo-MT是心肌炎后心肌纖維化的重要始動因素，并推測出TGF-β1是該過程的重要調(diào)控因子。
　　第四部分:BMP7對病毒性心肌炎小鼠心肌纖維化的影響及其機制
　　[目的]：心肌纖維化是病毒性心肌炎的特征，與病程和預(yù)后密切相關(guān);逆轉(zhuǎn)纖維化進程，有助于疾病的恢復(fù)。BMP7是TGF-β家族中的一員，認為有抵抗TGF-β1的作用。本研究通過外源性的予以BMP7干預(yù)，觀察其對病毒性心肌炎小鼠心功能及

18、心肌纖維化的影響，并探討其可能的機制。
　　[方法]：qPCR法觀察病毒性心肌炎病程中BMP7和TGF-β1的表達量的變化;小動物超聲心動圖、HE和SR染色觀察BMP7干預(yù)后小鼠心功能的恢復(fù)、小鼠心肌炎癥浸潤及膠原沉積情況。共聚焦檢測觀察BMP7干預(yù)后End-MT變化情況。免疫印跡分析可能的信號通路分子TGF-β1、p-smad3、smad3、smad4、Wnt和β-catenin的蛋白含量。
　　[結(jié)果]：qPCR法發(fā)現(xiàn)病

19、毒性心肌炎心肌組織中BMP/TGF-β1比值持續(xù)性下降。BMP7干預(yù)后，能提高小鼠生存率，心肌組織炎癥浸潤和纖維化程度降低。BMP7能顯著降低心肌炎小鼠的Endo-MT、內(nèi)皮細胞與成纖維細胞標志物共定位現(xiàn)象明顯降低。免疫印跡結(jié)果，BMP7能使心肌炎心肌組織中升高的TGF-β1、p-smad3、smad3、smad4和Wnt、β-catenin蛋白水平。
　　[結(jié)論]：本研究闡明了BMP7能夠延緩病毒性心肌炎心肌纖維化的進程，其作用