鈍鱗紫背苔中肉桂醇脫氫酶的基因克隆和功能鑒定.pdf

1、苔蘚植物是從水生向陸生過渡的重要類群，含有萜類、聯(lián)芐、黃酮、木脂素和木質素等多種多樣的次級代謝產物，具有廣泛的生物活性。此外，這些次級代謝產物在苔蘚植物適應陸地環(huán)境中起了重要作用。其中木質素能夠維持植物正常結構、輸導水分和養(yǎng)料、防御不良外界環(huán)境侵襲。由于缺少基因信息，苔蘚植物木質素生物合成途徑中的很多重要關鍵酶基因尚未被克隆和鑒定。肉桂醇脫氫酶(Cinnamylalcoholdehydrogenase，CAD)是木質素單體生物合成中的關

2、鍵酶，催化最后一步還原反應，將五種羥基化、甲基化程度不同的醛還原成為對應的醇。CAD基因是一個多基因家族，根據(jù)系統(tǒng)進化分析和基因結構功能的差異可以將大部分CAD基因分為三類。
　　 本文從鈍鱗紫背苔（Plagiochasmaappendiculatum）的cDNA文庫中得到兩個注釋為肉桂醇脫氫酶基因的序列，分別命名為PaCAD1和PaCAD2。將它們構建到原核表達載體上并且轉入表達型大腸桿菌BL21(DE3)中進行蛋白誘導表達，

3、表達出的蛋白純化后進行體外酶活鑒定。并合成了酶反應所需底物和產物標準品。酶反應結果顯示PaCAD1和PaCAD2對五種底物對羥基肉桂醛(p-coumarylaldehyde)、咖啡醛（caffeylaldehyde）、松柏醛(coniferylaldehyde)、5-羥基松柏醛(5-hydroxyconiferylaldehyde)和芥子醛（sinapylaldehyde）均有催化活性。酶學動力學分析結果表明PaCAD1和PaCAD2的

4、最適底物分別為咖啡醛和松柏醛，兩酶對對羥基肉桂醛也有較強催化活性，對5-羥基松柏醛和芥子醛催化活性較低。進化分析結果顯示，PaCADl和PaCAD2屬于第Ⅱ類肉桂醇脫氫酶。經過序列比對，發(fā)現(xiàn)第Ⅱ類中部分已驗證過功能的基因同PaCAD1和PaCAD2具有保守結構域VTG(X)2G(X)9L(X)5。同時，測定了鈍鱗紫背苔的葉狀體和愈傷組織中的木質素含量，結果顯示葉狀體中的含量明顯高于愈傷組織，這與PaCAD2在葉片中的表達顯著高于愈傷組織