人參皂苷Rh2對(duì)人乳腺癌細(xì)胞多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)作用及其相關(guān)機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、乳腺癌的發(fā)病率呈每年上升的趨勢，在女性惡性腫瘤死亡原因中占第二位。它是一類危害婦女健康的主要惡性腫瘤，其常規(guī)的治療方法主要有化療、放療、手術(shù)和內(nèi)分泌治療等,但是與其它的很多惡性腫瘤一樣，乳腺癌的多藥耐藥(mulfidrugresistance，MDR)特性嚴(yán)重地限制了化療的實(shí)施。
　　腫瘤細(xì)胞對(duì)抗癌藥物產(chǎn)生耐藥性，尤其是多藥耐藥性，是惡性腫瘤化療失敗的主要原因，也是腫瘤化療領(lǐng)域中急需解決的難題。乳腺癌的多藥耐藥是指腫瘤細(xì)胞對(duì)某種抗

2、腫瘤藥物產(chǎn)生耐藥的同時(shí)，對(duì)作用機(jī)制和結(jié)構(gòu)完全不同的其它抗腫瘤藥物也存在耐藥的特性，它形成的機(jī)制主要包括腫瘤細(xì)胞減少對(duì)藥物的迸入而泵出藥物相對(duì)增多，藥物靶點(diǎn)的改變，細(xì)胞周期檢測點(diǎn)的紊亂，DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)障礙以及細(xì)胞凋亡途徑變化等?？朔嗨幠退幱袃煞N方法首先是開發(fā)對(duì)MDR腫瘤細(xì)胞不具有抗藥性的新抗癌藥物，其次是尋找MDR逆轉(zhuǎn)劑與抗癌藥物合用，恢復(fù)MDR腫瘤細(xì)胞對(duì)抗癌藥物的敏感性。雖然目前有很多乳腺癌多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑在動(dòng)物模型和體外細(xì)胞培養(yǎng)中

3、都具有很好的逆轉(zhuǎn)功效，但是在實(shí)際的臨床實(shí)驗(yàn)中，這些耐藥逆轉(zhuǎn)劑由于干擾傳統(tǒng)的抗癌藥物藥代動(dòng)力學(xué)、還由于因可引起嚴(yán)重的毒副作用等，至今都沒有取得預(yù)期的臨床效果，因此急需開發(fā)新的有效逆轉(zhuǎn)劑來逆轉(zhuǎn)MDR。
　　P-gp是多藥耐藥基因-1(multidrug resistance gene-1，MDR-1)編碼的一種跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，能將化療藥物從細(xì)胞內(nèi)泵出，降低細(xì)胞內(nèi)的有效藥物濃度從而導(dǎo)致多藥耐藥，具有 ATP酶活性。 EMMPRIN（ext

4、racellular matrix metalloproteinase inducer，CD147，basigin)為單次跨膜糖蛋白，在腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)，是免疫球蛋白超家族成員，能促進(jìn)成纖維細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生MMPs，和腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metaloproteinases，MMPs)是目前已知的能夠降解膠原纖維的唯一酶類，參與腫瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)和

5、基底膜(basement membrane，BM)的降解，是一族鋅肽酶超家族?；|(zhì)金屬蛋白酶在很多轉(zhuǎn)移癌中的表達(dá)明顯增高，與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。基質(zhì)金屬蛋白酶成員中，基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)和基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)因?yàn)槟軌蛱禺愋缘亟到饧?xì)胞基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分IV型膠原，從而在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮最重要和最

6、直接的作用。
　　耐藥的腫瘤細(xì)胞與敏感細(xì)胞相比，表達(dá)更高的CD147和MMPs，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)P-糖蛋白底物能促進(jìn)耐藥腫瘤細(xì)胞的EMMPRIN和MMPs表達(dá)，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的浸潤轉(zhuǎn)移能力，這些實(shí)驗(yàn)表明臨床上不恰當(dāng)?shù)幕煂?duì)腫瘤患者的病情產(chǎn)生不利的影響，還有可能促進(jìn)癌細(xì)胞的浸潤轉(zhuǎn)移。用有效逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的藥物逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥，能否同時(shí)影響腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移特性，目前文獻(xiàn)報(bào)道甚少。
　　中藥治療腫瘤不僅作用途徑比較廣泛，而且毒副作用小。近年來，大

7、量的實(shí)驗(yàn)研究表明，許多復(fù)方制劑及單味中藥的有效成分在體外實(shí)驗(yàn)中有逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞MDR的作用。人參皂苷Rh2（Ginsenoside-Rh2）具有抗衰老、抗疲勞、抗血小板聚集、抗輻射等多種生物功能，是五加科人參屬植物的主要活性成分。隨著研究的深入，該類化合物在癌癥的治療和預(yù)防方面具有很強(qiáng)的活性。人參皂苷可通過多種機(jī)制發(fā)揮其抗腫瘤活性，如逆轉(zhuǎn)耐藥，提高化療藥物敏感性；直接抑制瘤細(xì)胞的生長；誘導(dǎo)瘤細(xì)胞的凋亡及分化；作用于腫瘤侵襲的多個(gè)環(huán)節(jié)抑制腫

8、瘤的轉(zhuǎn)移；影響代謝和調(diào)節(jié)免疫功能；也可通過影響細(xì)胞內(nèi)多種酶活性，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)疾病的抵抗能力，從而間接地抑制腫瘤的生長。
　　針對(duì)人參皂苷逆轉(zhuǎn) MDR的作用，研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷 Rg3可以增加 KBV20C對(duì)多種化療藥物的敏感性；并且抑制了羅丹明123從KBV20C細(xì)胞內(nèi)的外排。人參皂苷 Rh2在實(shí)驗(yàn)所選定的劑量下對(duì) B16-BL6細(xì)胞自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移具有明顯的抑制作用，其作用機(jī)制與抑制基質(zhì)金屬蛋白酶有關(guān)，并證明人參皂苷 Rh2對(duì)正常細(xì)胞

9、毒性作用甚低。但有關(guān)人參皂苷Rh2逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥的同時(shí)影響腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移作用的研究尚未見報(bào)導(dǎo)，因此，本研究以耐阿霉素乳腺癌細(xì)胞系(MCF7/AdrR)作為靶細(xì)胞，研究人參皂苷 Rh2對(duì)耐藥細(xì)胞的耐藥逆轉(zhuǎn)作用，并從誘導(dǎo)耐藥細(xì)胞的凋亡及人參皂苷Rh2對(duì)耐藥侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基因表達(dá)的影響，闡明人參皂苷Rh2逆轉(zhuǎn)耐藥的可能機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
　　1. MTT檢測結(jié)果顯示5～40 mol/L的GS-Rh2對(duì)MCF7/Adr無明顯細(xì)胞

10、毒作用，細(xì)胞存活率大于90％，MCF7/Adr對(duì)0.2～1.0μg／mL的ADM完全耐受，細(xì)胞存活率大于95％。
　　2.檢測結(jié)果顯示5～40μmol/L的人參皂苷Rh2與1.0μg/mL的ADM聯(lián)合應(yīng)用，細(xì)胞存活率明顯下降，細(xì)胞存活數(shù)分別是單用ADM組的63%，50%，31%，28%，通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度發(fā)現(xiàn)，5～40μmol/L的人參皂苷 Rh2與1.0μg/mL的ADM聯(lián)合應(yīng)用細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)ADM的熒光強(qiáng)度明顯升高

11、，細(xì)胞內(nèi)ADM熒光強(qiáng)度分別是 ADM單獨(dú)作用組的1.09，1.55，1.61，2.37倍，其差異均具有顯著性意義。
　　3.熒光顯微鏡顯示MCF7/AdrR細(xì)胞經(jīng)GS-Rh2作用后呈較明顯的凋亡形態(tài)學(xué)改變，ADM+Rh2不同濃度組細(xì)胞核數(shù)目明顯減少，有大量固縮變形的細(xì)胞核，染色質(zhì)濃縮，表現(xiàn)為濃染致密的熒光顆粒，有凋亡小體形成,尤其ADM與Rh2大劑量聯(lián)合用藥組凋亡最明顯。
　　4.流式細(xì)胞儀檢測證實(shí)，GS-Rh2能在一定濃度

12、范圍內(nèi)誘導(dǎo)MCF7/AdrR細(xì)胞凋亡，GS-Rh2與ADM聯(lián)合作用組的凋亡率為(47.08％)，高于對(duì)照組(8.51％)和阿霉素組(15.20％)(P均<0.05)。Rh2+ADM各濃度組作用于MCF7/AdrR細(xì)胞株均出現(xiàn)誘導(dǎo)G0/G1期阻滯，阻滯細(xì)胞由G1期向S期的轉(zhuǎn)化，隨Rh2作用濃度的增加G0/G1期細(xì)胞含量上升，S期細(xì)胞下降，G2/M期與對(duì)照組比較無明顯的變化。
　　5. Rh2組和ADM組的Fas、Bax、Bcl-2、

13、Bcl-xL蛋白表達(dá)與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)汁學(xué)意義。ADM+Rh2不同濃度組作用于MCF7/AdrR細(xì)胞使Fas、Bax蛋白的表達(dá)增高，Rh2濃度為40μmol/L時(shí)蛋白表達(dá)增高最明顯，Bcl-2蛋白的表達(dá)降低，Bcl-xL蛋白的表達(dá)在藥物作用前后無明顯的變化。
　　6.首先 RT-PCR和 Western blot檢測結(jié)果顯示1.0μg/mLADM作用于MCF7/Adr細(xì)胞，與對(duì)照組相比，細(xì)胞P-gp、EMMPRIN和MMP1、M

14、MP2、MMP9蛋白和mRNA水平升高，進(jìn)而又觀察了人參皂苷Rh2對(duì)細(xì)胞P-gp、EMMPRIN和MMP1、MMP2、MMP9表達(dá)的影響。結(jié)果顯示當(dāng)人參皂苷Rh2與ADM聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，人參皂苷Rh2也能明顯抑制ADM對(duì)細(xì)胞上述蛋白和mRNA水平的上調(diào)，且人參皂苷Rh2對(duì)上述蛋白表達(dá)的下調(diào)與人參皂苷Rh2濃度相關(guān)，呈濃度依賴性。
　　7.人參皂苷Rh2作用于MCF7/Adr細(xì)胞后，經(jīng)transwell chamber實(shí)驗(yàn)檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)

15、 ADM+Rh2不同濃度組與對(duì)照組相比細(xì)胞穿過覆蓋 Matrigel或沒有覆蓋Matrigel帶孔濾膜的數(shù)目均有所減少；與對(duì)照組相比人參皂苷 Rh2明顯抑制了MCF7/Adr細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移，其抑制率分別為16%、26%、49%、74%和18%、23%、52%、78%。而ADM組與對(duì)照組相比，MCF7/Adr細(xì)胞穿過覆蓋 Matrigel或沒有覆蓋Matrigel帶孔濾膜的數(shù)目增多。
　　以上結(jié)果提示：1.人參皂苷 Rh2可以有效逆

16、轉(zhuǎn)乳腺癌細(xì)胞耐藥細(xì)胞系MCF7/ADM的耐藥性，是一種安全、高效的MDR逆轉(zhuǎn)劑。其耐藥逆轉(zhuǎn)作用與 P-gp有關(guān),人參皂苷Rh2有可能直接或間接作用于P-gp，使其功能減退或失活,Rh2作為鈣通道阻滯劑與抗腫瘤藥物競爭 P-gp的結(jié)合位點(diǎn)，從而抑制其跨膜泵作用，使抗腫瘤藥物的細(xì)胞外排降低，提高細(xì)胞內(nèi)藥物濃度而逆轉(zhuǎn)耐藥。2. GS-Rh2能抑制體外培養(yǎng)的MCF7/AdrR細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡。3.誘導(dǎo)MCF7/AdrR細(xì)胞凋亡可能是通過上調(diào)