臍帶血干細胞及臍帶間充質(zhì)干細胞對失代償期肝炎后肝硬化患者肝臟功能恢復的研究.pdf

1、近年來，患者自體骨髓干細胞移植在肝硬化治療中的良好效果已經(jīng)得到認可，但該治療方法存在諸多限制，比如:采集過程痛苦，數(shù)量不足，分化能力不足等。體內(nèi)外實驗提示臍血干細胞及臍帶間充質(zhì)干細胞在自我更新，增殖分化和擴增潛能方面均優(yōu)于骨髓干細胞。本研究的目的是建立分離臍血干細胞及臍帶間充質(zhì)干細胞分離培養(yǎng)的方法，并觀察兩者植入對失代償期肝炎后肝硬化的臨床效果，以尋求一種安全、有效的治療肝炎后肝硬化的方法。
　　第一步無菌條件下采用負收集法分離臍

2、血干細胞，同時采用酶消化法分離臍帶間充質(zhì)干細胞。觀察兩種干細胞的形態(tài)，并通過流式細胞儀進行進一步鑒定。
　　第二步選擇47例失代償期肝炎后肝硬化患者，在抗病毒治療的基礎(chǔ)上，其中臍血干細胞治療組（27例），將臍血干細胞通過肝固有動脈介入和靜脈輸注途徑植入。臍帶間充質(zhì)干細胞治療組（20例），采用同樣方法植入。
　　觀察干細胞植入前和植入后半個月、1個月、3個月及6個月時患者血清學指標改變，主要包括肝功能指標:血漿白蛋白水平(AL

3、B)、總膽紅素(TBIL)水平及血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)，血常規(guī)指標:血小板(PLT)、白細胞(WBC)及凝血功能指標:凝血酶原時間(PT)，腫瘤標記物:甲胎蛋白(AFP)。并對患者治療前及治療后3個月B超結(jié)果進行比較，同時觀察患者臨床癥狀、體征（乏力、納差、肝病面容、蜘蛛痣等）改善情況和術(shù)后不良反應。
　　采集的臍血量約為110ml(100-130ml)，通過負收集法單份臍血可分離獲得干細胞平均數(shù)為2.31

4、×108。倒置顯微鏡下觀察，細胞分布均勻，大小均勻，呈圓形，透亮，折光性強，細胞活性＞95％。流式細胞儀檢測結(jié)果:CD34+細胞占0.23％，活率為72.71％。無細胞污染事件發(fā)生。
　　通過酶消化法，從臍帶組織中成功獲得間充質(zhì)干細胞，細胞分離培養(yǎng)至貼壁生長至80-90％融合約需10-14天。后大約3-5天傳代一次。倒置顯微鏡下觀察，原代細胞呈扁平條索狀。P1、P2、P3、P4代細胞形態(tài)觀察:細胞形態(tài)較均一，折光度好。細胞膜表面有

5、小的突起，胞核位于胞體的中央，為圓形或橢圓形，胞質(zhì)豐富，呈成纖維樣細胞形態(tài)，平行排列生長或渦旋狀生長。
　　在臍血干細胞治療組中我們發(fā)現(xiàn)，術(shù)前與術(shù)后3個月、6個月AST、TBIL、CHE和ALB水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05）。白細胞計數(shù)在第3個月后顯著增加(P＜0.05），第6個月出現(xiàn)下降。血小板計數(shù)無明顯變化，但逐漸改善。AFP在第3個月較治療前有明顯差異(P＜0.05)，第6個月出現(xiàn)下降。細胞植入后3個月左右行腹

6、部超聲檢查，門靜脈直徑減小13例，增大12例，不變2例。脾臟厚度16例減小，11例增大。在治療過程中無臟器衰竭及急性或慢性GVHD的病例。發(fā)熱病例4例，皮疹3例。植入細胞半個月，患者的精神、飲食改善明顯。腹脹、乏力不適好轉(zhuǎn)。植入后6個月者腹腔積液減少率為81.48％(22/27)，食欲、乏力好轉(zhuǎn)率為88.89％(24/27)，肝掌及蜘蛛痣減輕率為51.85％(14/27)。
　　臍帶間充質(zhì)治療組，術(shù)前與術(shù)后ALB水平在第1個月即有

7、顯著差異（P＜0.05），持續(xù)到第6個月。術(shù)后3個月，6個月時AST、TBIL和PT水平較術(shù)前比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。白細胞及血小板計數(shù)無顯著變化，但逐漸改善。AFP水平術(shù)后第1個月，第3個月較術(shù)前比較，有顯著性差異(P＜0.05），第6個月下降，無顯著性差異。患者細胞植入后3個月左右行腹部超聲檢查，門靜脈直徑減小7例，增大9例，不變4例。脾臟厚度11例減小，9例增大。在治療過程中無臟器衰竭病例，無急性或慢性GVHD的

8、病例。發(fā)熱病例8例。植入細胞半個月后，腹脹、乏力不適逐漸緩解，食欲較輸注前好轉(zhuǎn)。植入后6個月，患者腹水減少率為80％(16/20)，腹脹、乏力不適改善率90％(18/20)，肝掌及蜘蛛痣減輕率為50％(10/20)。通過兩種治療方案對患者臨床癥狀及體征、腹部B超結(jié)果（門靜脈直徑、腹水、脾臟厚度）有效率的分析，兩種治療方法無明顯差異（P＞0.05）。
　　總之，臍血干細胞分離及臍帶間充質(zhì)干細胞分離培養(yǎng)方法安全、高效、穩(wěn)定，兩者對失代