SOCS1基因與慢加急性乙型肝炎肝衰竭病情評價及激素治療的研究.pdf

1、第一部分SOCS1基因在慢加急性乙型肝炎肝衰竭中的表達及其甲基化狀態(tài)的檢測
　　研究背景
　　慢加急性乙型肝炎肝衰竭(Acute-on-chronichepatitisBliverfailure，ACHBLF)是指由乙型肝炎病毒(HepatitisBvirus，HBV)慢性感染的基礎上，出現(xiàn)急性肝功能失代償，繼發(fā)嚴重的肝臟損害的嚴重癥候群。ACHBLF在我國慢性乙型肝炎患者中發(fā)病率較高，以凝血功能障礙，黃疸，肝性腦病，腹水為

2、主要表現(xiàn)，最終導致多器官功能障礙綜合征，病程兇險死亡率極高。目前，細胞因子在肝衰竭的發(fā)病機制中的作用日益受到人們的重視，一方面細胞因子可使淋巴細胞活化，參與免疫反應清除病毒;另一方面細胞因子直接參與和加重肝衰竭的演變過程，引起免疫病理反應導致肝細胞的壞死。
　　細胞因子信號轉導抑制因子(Suppressorofcytokinesignaling，SOCS)1屬于SOCS蛋白家族，是一類由細胞產(chǎn)生并反饋性阻斷細胞因子信號轉導過程的負

3、性調節(jié)因子之一。研究發(fā)現(xiàn)SOCS1可通過負反饋環(huán)抑制炎癥細胞因子信號的傳導，在多種免疫反應中發(fā)揮重要作用。而HBV可能導致宿主基因甲基化，使SOCS1表達降低，對炎癥因子的抑制作用減弱，可能會加重肝臟的炎癥損害。
　　研究表明，SOCS1基因的甲基化與慢性病毒性肝炎的炎癥、纖維化及抗病毒治療存在著一定的相關性。但是在慢加急性乙型肝炎肝衰竭中SOCS1基因表達及啟動子的甲基化的情況與炎癥因子的關系還未有研究。
　　研究目的

4、r>　　通過檢測ACHBLF患者外周血單個核細胞內SOCS1的mRNA表達情況、啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)及血漿中相關炎癥因子白介素-6(interleukin-6，IL-6)、干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)和腫瘤壞死因子-α（tumornecrosisfactor-α，TNF-α）水平。并與慢性乙型病毒性肝炎(CHB)患者及正常人進行比較，分析SOCS1的甲基化與肝臟免疫損傷的關系，并初步探討其在慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者

5、發(fā)病機制中的作用及臨床相關性。
　　研究方法
　　研究對象為2009年6月到2013年3月間在山東大學齊魯醫(yī)院和煙臺傳染病醫(yī)院就診和治療的60例ACHBLF患者，60例CHB患者，以及30例門診健康體檢者作為對照。ACHBLF患者診斷符合亞太肝臟研究協(xié)會年會(APASL)標準。采用實時熒光定量PCR(real-timequantitativePCR，RT-PCR)方法檢測ACHBLF、CHB患者及健康對照外周血單個核細胞中S

6、OCS1的表達情況，并通過甲基化特異性PCR(Methylation-specificPCR，MSP)檢測SOCS1啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài)。應用酶聯(lián)免疫吸附劑測定（Enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA）方法檢測ACHBLF、CHB患者及健康對照血漿中IL-6，IFN-γ和TNF-α的水平。并將SOCS1表達量IL-6，IFN-γ和TNF-α的水平與病情嚴重指標總膽紅素(Totalbilirubin，TB

7、IL)、凝血酶原活動度（Prothrombinactivity,PTA）、血清丙氨酸轉氨酶(Alanineaminotransferase，ALT)、HBV-DNA及MELD評分進行相關分析。比較不同SOCS1基因啟動子去甲基化狀態(tài)患者臨床指標及預后。統(tǒng)計學分析采用SPSS13.0軟件包進行，結果用均數(shù)±標準差（(x)±s）表示，組間差異采用兩組獨立樣本資料的t檢驗或卡方檢驗，相關分析采用Pearson線性相關分析。P＜0.05為差異具

8、有統(tǒng)計學意義。
　　研究結果
　　1.ACHBLF患者組和CHB患者組血漿IL-6及TNF-α水平明顯高于健康對照組(P＜0.05);ACHBLF患者組的IL-6及TNF-α水平在三組中最高，明顯高于CHB患者組(P＜0.05)。ACHBLF患者組血漿IFN-γ水平明顯高于CHB患者組，但與健康對照組相比無明顯統(tǒng)計學差異。
　　2.ACHBLF及CHB患者的SOCS1mRNA表達量明顯高于健康對照組(P＜0.01);A

9、CHBLF患者組的SOCS1表達量明顯高于CHB患者組(P＜0.05)。
　　3.ACHBLF患者細胞因子IL-6/IFN-γ/TNF-α水平與TBIL、ALT及MELD評分呈正相關，與PTA呈負相關，與HBV-DNA載量無明顯相關性。
　　4.ACHBLF患者的SOCS1基因mRNA水平與TBIL、ALT成負相關，與PTA成正相關。另外SOCS1表達量與ACHBLF患者IL-6/IFN-γ/TNF-α水平分別成負相關。與H

10、BVDNA載量及MELD評分無明顯相關性。
　　5ACHBLF患者組的SOCS1基因啟動子的甲基化率(35.0％)明顯高于CHB患者組(16.7％，x2=3.52，P=0.003)，在30例健康對照中均未發(fā)現(xiàn)SOCS1啟動子區(qū)的甲基化。
　　6.在ACHBLF及CHB患者患者中，甲基化組的SOCS1基因表達量明顯低于非甲基化組。ACHBLF患者SOCS1啟動子區(qū)甲基化組的IL-6/IFN-γ/TNF-α水平、TBIL和ALT

11、水平明顯高于非甲基化組，而PTA水平則明顯低于非甲基化組。另外，ACHBLF患者甲基化組的MELD積分及死亡率高于非甲基化組。
　　結論
　　SOCS1的表達量與患者的病情嚴重程度成負相關，SOCS1基因啟動子區(qū)的甲基化可能參與了相關炎癥因子對慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者肝功能的免疫損害。
　　第二部分SOCS1基因甲基化及表達與糖皮質激素治療慢加急性乙型肝炎肝衰竭的研究
　　研究背景
　　慢加急性肝衰竭的發(fā)

12、生不同時相依次經(jīng)受了免疫損傷、缺血缺氧性損傷和內毒素血癥的三重打擊，其中炎癥因子參與的免疫損傷在肝衰竭發(fā)生中起著至關重要的作用。肝病尤其是肝衰竭患者普遍存在著腎上腺功能不全的情況，因此早期使用糖皮質激素是治療慢加急性肝衰竭的方法之一，近年來隨著對糖皮質激素不良反應及并發(fā)癥防治手段的增強，使用糖皮質激素調節(jié)患者機體免疫功能、抑制炎性反應已經(jīng)成為治療慢加急性肝衰竭的一種選擇。
　　第一部分的研究已經(jīng)證實了SOCS1基因啟動子區(qū)的甲基化

13、參與了相關炎癥因子對ACHBLF患者的肝功能損害。但ACHBLF患者中糖皮質激素對SOCS1的影響及對患者預后是否有提示作用尚未有研究。既往研究資料證實糖皮質激素在體內、體外環(huán)境均能夠促進SOCS1基因表達并引起甲基化狀態(tài)改變。據(jù)此我們推測對ACHBLF患者采用糖皮質激素治療可能影響SOCS1對相關的炎癥反應的調控。本研究有助于我們認識糖皮質激素治療對ACHBLF患者SOCS1的表達及甲基化狀態(tài)的影響，揭示SOCS1對糖皮質激素治療AC

14、HBLF的提示作用，為提供臨床治療理論依據(jù)和新的途徑。
　　研究目的
　　通過研究糖皮質激素治療對ACHBLF患者SOCS1表達，甲基化狀態(tài)及相關基因、細胞因子的影響，進一步探討分析SOCS1表達與糖皮質激素激素治療預后的相關性。
　　研究方法
　　研究對象為2007年12月到2013年5月間在山東大學齊魯醫(yī)院就診和治療的ACHBLF患者47例，以及30例門診健康體檢者作為對照。ACHBLF患者診斷符合亞太肝臟研

15、究協(xié)會年會(APASL)標準。所有ACHBLF患者確診后均給予糖皮質激素治療4周。應用RT-PCR法檢測ACHBLF患者治療前，治療第3天及治療28天后SOCS1及干擾素調節(jié)受體(interferonregulatoryfactors，IRF)-1，趨化因子配體(C-X-Cmotifligand，CXCL)9，CXCL10，CXCL11的表達情況，應用ELISA技術檢測ACHBLF患者和健康對照血漿中IL-6及TNF-α水平，結合患者臨

16、床指標，與MELD評分進行相關分析，用甲基化特異性PCR法(MethylationSpecificPCR，MSP)測定SOCS1基因啟動子的甲基化狀態(tài)，分析糖皮質激素對SOCS1基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)的影響，探討SOCS1表達與糖皮質激素治療的相關性。統(tǒng)計學分析采用SPSS13.0軟件包進行，結果用均數(shù)±標準差（(x)±s）表示，組間差異采用兩組獨立樣本資料的t檢驗，相關分析采用Pearson線性相關分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意

17、義。
　　研究結果
　　1.激素治療后ACHBLF患者肝性腦病和腹水癥狀均有明顯改善。MELD積分明顯下降。
　　2.激素治療前，ACHBLF患者SOCS1基因mRNA基因表達水平明顯高于健康對照(P＜0.05);ACHBLF生存組的SOCS1mRNA表達量明顯高于死亡組(P=0.007)。激素治療第三天，生存組SOCS1表達量上升;治療第28天，生存組SOCS1基因mRNA表達量明顯下降，而死亡組在治療中及治療后SO

18、CS1基因mRNA表達量無明顯變化。
　　3.激素治療前，ACHBLF患者血漿IL-6及TNF-α水平明顯高于健康對照(P＜0.05);激素治療后第三天，ACHBLF患者IL-6及TNF-α水平出現(xiàn)明顯下降，其中死亡組TNF-α水平明顯高于生存組，而兩組IL-6水平在治療第3天無明顯差異。激素治療第28天，生存組IL-6及TNF-α水平均明顯低于死亡組(P＜0.05)。ACHBLF患者中IFN-γ及STAT1相關基因表達量與健康對

19、照相比均有不同程度上升，并在激素治療3天出現(xiàn)明顯下降，在第28天下降均超過30％。
　　4.SOCS1表達水平與MELD積分在激素治療前、后均存在明顯的負相關性。
　　5.激素治療前，ACHBLF患者TBIL水平明顯高于健康對照(P＜0.05)，PTA水平明顯低于健康對照;ACHBLF患者生存組與死亡組TBIL及PTA水平無明顯差別(P＞0.05)。激素治療第28天，生存組患者TBIL水平明顯下降，PTA明顯上升;而死亡組無

20、明顯改善。在90天隨訪結束時采用激素治療的ACHBLF患者死亡率為52.3％。采用小樣本生存率估計(Kaplan-Meier法)對最初存在甲基化及無甲基化的患者分別進行生存分析，發(fā)現(xiàn)激素治療能夠明顯提高SOCS1非甲基化患者的生存率(P＜0.05)。
　　6.激素治療前有34％的ACHBLF患者存在SOCS1基因的甲基化情況，而30例健康對照中均未發(fā)現(xiàn)SOCS1啟動子區(qū)的甲基化。激素治療第3天MSP檢測ACHBLF患者未發(fā)現(xiàn)甲基化

21、狀態(tài)明顯改變，激素治療第28天檢測發(fā)現(xiàn)，8名最初存在SOCS1基因啟動子甲基化的患者未檢測到SOCS1的甲基化狀態(tài)，其中全部6名最初存在甲基化的生存組患者中有5人出現(xiàn)去甲基化，而10例死亡組患者中僅有3例出現(xiàn)了去甲基化情況。
　　結論
　　慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者中，早期應用糖皮質激素能夠明顯改善患者肝功能，提高SOCS1基因非甲基化者的生存率，而出現(xiàn)SOCS1甲基化的ACHBLF患者對糖皮質激素治療效果反應較差，死亡率明