山羊重組促卵泡素（FSH）及其長(zhǎng)效類似物基因在巴斯德畢赤酵母中的表達(dá)研究.pdf

1、FSH對(duì)配子的發(fā)生、分化、成熟及與生殖有關(guān)的行為的發(fā)生都起著重要的作用。FSH制劑可廣泛的應(yīng)用于動(dòng)物的生殖調(diào)控，提高其繁殖潛力，也可在人類輔助生殖臨床上誘導(dǎo)排卵，治療生殖方面的疾病。重組FSH可避免天然激素制劑在應(yīng)用過(guò)程中的不足，為FSH的高效、廣泛的應(yīng)用帶來(lái)了契機(jī)。本研究在獲得山羊FSH及其長(zhǎng)效類似物基因cDNA序列的基礎(chǔ)上，構(gòu)建其酵母表達(dá)載體在巴斯德畢赤酵母中進(jìn)行穩(wěn)定的表達(dá)，為高效表達(dá)重組FSI-I及其長(zhǎng)效類似物基因提供了必備的條件

2、。 根據(jù)FSH及其長(zhǎng)效類似物基因序列和酵母表達(dá)載體的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)了含有相應(yīng)酶切位點(diǎn)和可以去掉目的基因信號(hào)肽的特異性引物，分別以pVITRO-FStα,β-CTP，pVITRO-FSHβ．CTP-α為模板，PCR．?dāng)U增獲得含有特異性酶切位點(diǎn)的FSHα、FSHβ、FSHβ-CTP、FSHβ-CTP-α。將擴(kuò)增的目的基因與載體pPIC9K和pPICZα A經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRI和NotI雙酶切后，再進(jìn)行連接和轉(zhuǎn)化構(gòu)建含有目的基因的酵母

3、表達(dá)載體，經(jīng)PCR和測(cè)序驗(yàn)證正確后大提酵母表達(dá)載體。將純化的酵母表達(dá)載體經(jīng)酶切線性化后，再進(jìn)行純化和濃縮使其濃度為0.5～1μg、mL后，采用電轉(zhuǎn)化的方法將含F(xiàn)SH Q的載體分別與含有FSHβ、：FSHβ-CTP的載體共轉(zhuǎn)化到感受態(tài)的酵母細(xì)胞的基因組中，而含有FSHβ．CTP-α的載體單獨(dú)轉(zhuǎn)化到感受態(tài)的酵母細(xì)胞的基因組中；然后采用營(yíng)養(yǎng)缺陷型的培養(yǎng)基、含抗生素的培養(yǎng)基及PCR．的方法篩選陽(yáng)性酵母轉(zhuǎn)化子His<'+>及高拷貝轉(zhuǎn)化子，再利用M

4、M和MD培養(yǎng)基篩選甲醇利用快型菌落Mut<'+>。將His<'+>Mut<'+>型轉(zhuǎn)化子接種于BMGY培養(yǎng)基獲得生物量的菌體后，再用含0.5％甲醇的BMMY培養(yǎng)基誘導(dǎo)表達(dá)，每間隔24h取一次表達(dá)上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析及Western blot鑒定，然后用放射免疫的方法測(cè)定FSH的表達(dá)量。 結(jié)果顯示表達(dá)蛋白的分子量：FSH αβ約為27KD、FSHαβ-CTP約為28KD、FSHαβ-CTP-α約為29KD，與預(yù)期的大小