心理應(yīng)激對(duì)大鼠鋅代謝的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、心理應(yīng)激(psychological stress，PS)是機(jī)體通過認(rèn)識(shí)、評(píng)價(jià)而察覺到應(yīng)激源的威脅時(shí)引起的心理、生理機(jī)能改變的過程，是個(gè)體對(duì)面臨的威脅或挑戰(zhàn)作出適應(yīng)和應(yīng)付的過程。隨著社會(huì)的發(fā)展及各方面壓力的增加，來源于社會(huì)的精神心理因素的應(yīng)激對(duì)人類健康的影響越來越強(qiáng)烈，并成為重要的應(yīng)激源。許多研究證實(shí)，應(yīng)激雖不像生物或理化因素可以導(dǎo)致特定的疾病，卻可以非特異性的方式導(dǎo)致機(jī)體損害，如誘發(fā)冠心病、高血壓、消化性潰瘍、神經(jīng)精神疾病等疾病的發(fā)生

2、等。
　　 鋅是人體的必需微量元素之一，在體內(nèi)的含量?jī)H次子鐵。鋅參與機(jī)體眾多生物反應(yīng)，同時(shí)它又具有多種生物功能，其主要功能包括催化功能、結(jié)構(gòu)功能和調(diào)節(jié)功能，此外，鋅還廣泛參與細(xì)胞信號(hào)識(shí)別調(diào)節(jié)、第二信使代謝以及蛋白激酶和蛋白磷酸酶的功能調(diào)節(jié)等。鋅穩(wěn)態(tài)的維持依賴于一些鋅代謝相關(guān)功能蛋白的調(diào)節(jié)，包括金屬硫蛋白(metallothionein，MT)以及跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)體，后者主要包括鋅鐵調(diào)控蛋白(zrt，irt-like protein，ZI

3、P)和鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體(zinc transportors，ZnT)家族。
　　 細(xì)胞鋅穩(wěn)態(tài)容易受到胞外各種病理生理環(huán)境因素的影響，如炎癥，氧化應(yīng)激等，實(shí)驗(yàn)證明，在應(yīng)激條件下，胞內(nèi)游離鋅離子濃度可顯著上升，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞損傷。既往研究也發(fā)現(xiàn)熱環(huán)境、加速度刺激、噪聲等均可導(dǎo)致血清鋅水平顯著下降。結(jié)合上述研究，我們推測(cè)微量元素鋅在應(yīng)激過程中可能具有重要作用。一方面，各種應(yīng)激導(dǎo)致胞內(nèi)游離鋅濃度上升，使鋅在胞內(nèi)產(chǎn)生毒性作用，造成細(xì)胞損傷;另一方面

4、，應(yīng)激導(dǎo)致機(jī)體血清鋅下降，并可能導(dǎo)致體內(nèi)鋅的重新分布，從而影響體內(nèi)的抗氧化能力等，進(jìn)而影響機(jī)體的抗應(yīng)激能力。因此，了解心理應(yīng)激過程中機(jī)體鋅代謝的變化特點(diǎn)及其可能機(jī)制，有助于為研究解決應(yīng)激誘發(fā)損傷提供線索。
　　 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?
　　 本研究擬通過觀察心理應(yīng)激對(duì)大鼠鋅代謝，尤其是海馬鋅水平變化的規(guī)律，并對(duì)上述變化的可能機(jī)制進(jìn)行探討，不僅有助于了解心理應(yīng)激過程中鋅代謝的變化特點(diǎn)及其機(jī)制，而且在此基礎(chǔ)上為研究心理應(yīng)激相關(guān)疾病提供實(shí)

5、驗(yàn)依據(jù)和理論參考。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:
　　 1.動(dòng)物分組及喂養(yǎng)
　　 健康雄性SD大鼠，體重180-200g，適應(yīng)喂養(yǎng)3d后按體重隨機(jī)分為4組，每組分為兩小組:正常對(duì)照7天組、心理應(yīng)激7天組;正常對(duì)照14天組、心理應(yīng)激14天組;心理應(yīng)激14天脫應(yīng)激7天組，相應(yīng)對(duì)照組;心理應(yīng)激14天脫應(yīng)激14天組，相應(yīng)對(duì)照組。每小組15只大鼠。
　　 2.心理應(yīng)激動(dòng)物模型的建立
　　 采用Communication

6、 Box System制作大鼠心理應(yīng)激模型。放免試劑盒測(cè)定血清皮質(zhì)酮(CORT)含量。
　　 3.大鼠各組織鋅和血清鋅含量的測(cè)定
　　 采用原子吸收分光光度計(jì)火焰法測(cè)定。1g/L鋅標(biāo)準(zhǔn)貯備液由國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心提供。
　　 4.大鼠鋅表觀吸收率的計(jì)算
　　 鋅吸收率按經(jīng)典的代謝平衡法計(jì)算，即在一定時(shí)間內(nèi)計(jì)算食物鋅攝入量和糞便鋅排出量來計(jì)算鋅表觀吸收率。鋅表觀吸收率=（膳食鋅含量-糞便鋅含量）×100％/膳食

7、鋅含量。
　　 5.大鼠肝臟ZIP14和海馬ZnT1、ZnT3和ZIP1 mRNA表達(dá)量的測(cè)定
　　 采用實(shí)時(shí)定量熒光PCR法測(cè)定大鼠肝臟ZIP14和海馬ZnT1、ZnT3和ZIP1 mRNA表達(dá)水平。
　　 6.大鼠肝臟和海馬MT蛋白含量的測(cè)定
　　 ELISA法測(cè)定大鼠肝和海馬MT蛋白含量。
　　 7.大鼠海馬組織內(nèi)游離鋅離子的測(cè)定
　　 TSQ熒光染色法測(cè)定大鼠海馬組織冰凍切片游離鋅

8、離子的含量。
　　 8.檢測(cè)大鼠心理應(yīng)激后行為學(xué)的變化。
　　 利用自發(fā)活動(dòng)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠行為學(xué)指標(biāo)。
　　 9.統(tǒng)計(jì)方法
　　 使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Excel2007進(jìn)行數(shù)據(jù)匯總及繪圖，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05;采用兩樣本t檢驗(yàn)和one-way ANVOA進(jìn)行比較。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 1.心理應(yīng)激對(duì)大鼠血清CORT含量的影響
　　 心理應(yīng)激7天和1

9、4天組大鼠血清CORT含量較對(duì)照組明顯升高(P＜0.05)。脫應(yīng)激7天和14天后大鼠血清CORT含量恢復(fù)至正常水平，與相應(yīng)對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　 2.心理應(yīng)激對(duì)大鼠體增重的影響
　　 實(shí)驗(yàn)組大鼠與空白對(duì)照組大鼠的體增重相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）
　　 3.心理應(yīng)激對(duì)大鼠鋅吸收的影響
　　 心理應(yīng)激7天組和14天組與相應(yīng)對(duì)照組的鼠糧攝入量相比無明顯差異(P＞0.05

10、)，表明各組大鼠鋅攝入量無明顯差異。心理應(yīng)激7天后大鼠糞鋅排出量有所增加但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），心理應(yīng)激14天后大鼠糞鋅排出量增加，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。心理應(yīng)激7天組和14天組與相應(yīng)對(duì)照組相比鋅表觀吸收率均下降（P＜0.05），脫應(yīng)激7天和14天后，大鼠鋅表觀吸收率恢復(fù)至正常水平，與相應(yīng)對(duì)照組相比無明顯差異(P＞0.05)。
　　 4.心理應(yīng)激對(duì)大鼠血清和組織鋅含量的影響
　　 4.1

11、.心理應(yīng)激對(duì)大鼠血清鋅含量的影響
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，連續(xù)心理應(yīng)激7天和14天后，大鼠血清鋅含量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。脫應(yīng)激7天和14天后，大鼠血清鋅含量恢復(fù)至正常水平，與相應(yīng)對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　 4.2.心理應(yīng)激對(duì)大鼠各組織鋅含量的影響
　　 4.2.1.心理應(yīng)激對(duì)大鼠心、肝、脾、腎和小腸鋅含量的影響
　　 與空白對(duì)照組相比，大鼠心、脾、腎和

12、腸鋅含量在連續(xù)7天和14天心理應(yīng)激后無變化，大鼠肝鋅含量在連續(xù)心理應(yīng)激7天后無顯著變化，但大鼠肝鋅含量在連續(xù)應(yīng)激14天后顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。脫應(yīng)激7天和14天后肝鋅含量恢復(fù)至正常水平，與相應(yīng)對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。
　　 4.2.2.心理應(yīng)激對(duì)大鼠各腦區(qū)鋅含量的影響
　　 與空白對(duì)照組相比，在連續(xù)7天和14天心理應(yīng)激后，大鼠小腦、皮層鋅含量無變化，連續(xù)心理應(yīng)激7天及14天后海馬鋅含量均

13、下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。脫應(yīng)激7天和14天后，海馬血清鋅含量恢復(fù)至正常水平，與相應(yīng)對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。
　　 5.心理應(yīng)激對(duì)大鼠肝組織MT蛋白含量的影響
　　 心理應(yīng)激7天后大鼠肝MT蛋白含量上升，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。心理應(yīng)激14天后，與對(duì)照組相比，大鼠肝組織內(nèi)MT蛋白含量明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。脫應(yīng)激7天和14天后大鼠肝組織MT蛋白含量恢復(fù)至正常水平，

14、與相應(yīng)對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　 6.心理應(yīng)激對(duì)大鼠肝組織ZIP14mRNA水平的影響
　　 與空白對(duì)照組相比，7天應(yīng)激組大鼠肝ZIP14mRNA表達(dá)水平上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），14天應(yīng)激組大鼠肝組織ZIP14mRNA水平無顯著變化（P＞0.05）。
　　 7.心理應(yīng)激對(duì)大鼠海馬ZnT3、ZnT1和ZIP1mRNA水平的影響
　　 熒光實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，

15、與空白對(duì)照組比較，心理應(yīng)激7天組和14天組大鼠海馬內(nèi)ZnT3和ZnT1mRNA水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。脫應(yīng)激7天和14天后恢復(fù)至正常水平，與相應(yīng)對(duì)照組大鼠相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。心理應(yīng)激7天組大鼠海馬組織內(nèi)ZIP1mRNA水平下降差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，14天組大鼠水平恢復(fù)至正常水平，脫應(yīng)激7天和14后大鼠恢復(fù)至正常水平，與相應(yīng)對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　 8

16、.心理應(yīng)激對(duì)大鼠海馬MT蛋白含量的影響
　　 與空白對(duì)照組比較，心理應(yīng)激7天和14天組大鼠海馬組織內(nèi)MT蛋白含量均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。脫應(yīng)激7天和14天后，與相應(yīng)對(duì)照組相比，海馬內(nèi)MT蛋白含量恢復(fù)至正常水平，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　 9.心理應(yīng)激對(duì)大鼠海馬內(nèi)游離鋅離子的影響
　　 TSQ熒光染色結(jié)果顯示，心理應(yīng)激組海馬的熒光染色程度明顯高于對(duì)照組。
　　 10.心理應(yīng)激

17、對(duì)大鼠在強(qiáng)迫游泳與自發(fā)活動(dòng)實(shí)驗(yàn)中行為的影響
　　 連續(xù)心理應(yīng)激7天和14天后的大鼠在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中不動(dòng)的時(shí)間明顯長(zhǎng)于相應(yīng)的空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。
　　 與空白對(duì)照組大鼠相比，連續(xù)心理應(yīng)激7天和14天后，大鼠在自發(fā)活動(dòng)箱內(nèi)行進(jìn)的總路程明顯更短，休息時(shí)間更長(zhǎng)，速度更慢，且以上差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）
　　 結(jié)論:
　　 本研究通過Communication Box成功制造了心

18、理應(yīng)激模型，觀察了心理應(yīng)激情況下的鋅代謝變化及通過熒光實(shí)時(shí)定量PCR和ELISA觀察了心理應(yīng)激對(duì)與鋅代謝密切相關(guān)的主要分子的表達(dá)變化，并進(jìn)一步觀察PS對(duì)大鼠行為學(xué)的影響。主要結(jié)論如下:
　　 1.心理應(yīng)激引起大鼠鋅表觀吸收率的下降，這與心理應(yīng)激導(dǎo)致大鼠糞鋅排出量增加相關(guān)。
　　 2.心理應(yīng)激導(dǎo)致大鼠血清鋅含量下降，這與大鼠鋅表觀吸收率下降以及肝鋅蓄積相關(guān)，肝鋅蓄積與MT以及鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體ZIP14表達(dá)升高相關(guān)。