香港海鷗型菌喹諾酮耐藥的分子機制研究.pdf

1、目的：
　　香港海鷗型菌(Laribacter hongkongensis,LH)是2001年于香港首次發(fā)現的一種食源性致病菌,該菌主要引起社區(qū)性胃腸炎和旅行者腹瀉。在早期對香港海鷗型菌進行耐藥性研究時未發(fā)現其對喹諾酮類抗菌藥物耐藥,故有研究學者推薦喹諾酮類藥物作為治療該菌感染的首選藥物之一。然而隨著抗菌藥物濫用的持續(xù)存在,近幾年香港海鷗型菌開始出現對喹諾酮耐藥的情況,且耐藥性有逐步加重的趨勢,但其對喹諾酮的分子耐藥機制則不甚明了

2、。本研究從草魚和虎紋蛙中分離出香港海鷗型菌,并從這些分離株中篩選出喹諾酮耐藥株。對篩選得到的喹諾酮耐藥株進行藥物靶位基因、外排泵作用和質粒介導的喹諾酮耐藥基因的檢測和分析,以期全面了解香港海鷗型菌對喹諾酮類耐藥的分子機制,為該菌感染者抗菌治療的用藥選擇提供實驗室依據。
　　方法：
　　1.香港海鷗型菌的分離和對喹諾酮類藥物的敏感性測定
　　在2011年3月至9月期間,從廣州7個不同的菜市場采集新鮮宰殺的草魚和虎紋蛙的腸

3、道標本,采用選擇性培養(yǎng)基分離、生化鑒定和16SrRNA基因分子鑒定的方法分離出香港海鷗型菌菌株。采用紙片擴散法測定香港海鷗型菌各分離株對5種常見喹諾酮類藥物(萘啶酮酸、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、諾氟沙星和左氧氟沙星)的耐藥情況,同時采用瓊脂稀釋法測定各分離株對萘啶酮酸和環(huán)丙沙星的最低抑菌濃度(Minimal inhibitory concentration,MIC),篩選出在這兩種方法中均對環(huán)丙沙星耐藥的香港海鷗型菌菌株作為喹諾酮分子耐藥機制

4、的研究對象。
　　2.耐環(huán)丙沙星香港海鷗型菌藥物靶位基因突變的檢測和分析
　　用普通PCR的方法擴增香港海鷗型菌環(huán)丙沙星耐藥株和部分敏感株中的兩個藥物靶位基因--gyrA和parC基因的喹諾酮耐藥決定區(qū)(quinolone resistance-determining region,QRDR),并對PCR產物進行測序。測序結果與香港海鷗型菌中已知的gyrA和parC基因序列進行比對,找出耐藥株中喹諾酮耐藥決定區(qū)存在的突變位點

5、,并分析這些突變位點與其耐藥表型之間的關系。敏感株的測序結果用于對比分析。
　　3.耐環(huán)丙沙星香港海鷗型菌中主動外排泵作用的檢測和分析
　　采用外排泵抑制劑氰氯苯腙(CCCP)與環(huán)丙沙星(CIP)聯(lián)合應用的方法檢測香港海鷗型菌環(huán)丙沙星耐藥株的外排泵表型,分析耐藥株中是否存在外排泵作用機制。
　　4.耐環(huán)丙沙星香港海鷗型菌中質粒介導的喹諾酮耐藥基因的檢測和分析
　　用多重PCR的方法對香港海鷗型菌環(huán)丙沙星耐藥株進行

6、質粒介導的喹諾酮耐藥基因(qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS、aac(6’)-Ib-cr和qepA基因)的檢測,并將檢測結果與其耐藥性表現結合進行分析。
　　結果：
　　1.本文從廣州7個不同的菜市場共采集了614份草魚和虎紋蛙腸道標本,其中草魚魚腸443份,虎紋蛙腸道標本171份。從614份腸道標本中共分離出157株香港海鷗型菌,其中82株分離自草魚魚腸,75株分離自虎紋蛙腸道標本,兩者的分離率分別為18.5

7、1％(82/443)和43.86%(75/171)。經統(tǒng)計學分析后發(fā)現,香港海鷗型菌蛙株的分離率顯著高于魚株的分離率(χ2=41.66,P<0.001)。
　　2.(1)157株香港海鷗型菌對5種常見喹諾酮類抗生素耐藥率從高到低依次為:萘啶酮酸40.76%(64/157)、諾氟沙星16.56%(26/157)、環(huán)丙沙星15.29%(24/157)、恩諾沙星8.28%(13/157)和左氧氟沙星3.82%(6/157)。
　　

8、(2)香港海鷗型菌魚分離株只對萘啶酮酸耐藥,耐藥率為13.41%(11/82);所有魚分離株均對環(huán)丙沙星、恩諾沙星、諾氟沙星和左氧氟沙星敏感。而蛙分離株對5種喹諾酮類藥物表現出不同程度的耐藥性,對萘啶酮酸、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、諾氟沙星和左氧氟沙星的耐藥率分別為70.67%(53/75)、32%(24/75)、17.33%(13/75)、34.67%(26/75)和8%(6/75)。
　　(3)157株香港海鷗型菌萘啶酮酸和環(huán)丙沙星

9、的MIC50分別為32μg/ml和0.25μg/ml。
　　3.(1)從157株香港海鷗型菌中檢測出環(huán)丙沙星耐藥株21株,其中有19株發(fā)生gyrA基因突變,突變率為90.47%;18株發(fā)生parC基因突變,突變率為85.71%。gyrA基因以雙位點突變?yōu)橹?其中有9株發(fā)生T85I+D89N突變,有6株發(fā)生T85I+D89G突變;15株gyrA基因雙位點突變耐藥株對環(huán)丙沙星的MIC50和MIC90均為32μg/ml,4株gyrA基因

10、單位點突變耐藥株對環(huán)丙沙星的MIC50和MIC90也均為32μg/ml。parC基因發(fā)生S83R+R231C雙位點突變的有9株,發(fā)生S83R單個位點突變的也有9株。90.48%的耐藥株(19/21)gyrA和parC基因中含有兩個或兩個以上突變位點。有兩株耐藥株(W66和W68)的gyrA和parC基因均沒有發(fā)生突變。
　　(2)在CCCP濃度為0.1μg/ml條件下,21株環(huán)丙沙星耐藥株外排泵表型檢測結果均為陰性。
　　(

11、3)常見質粒介導的喹諾酮耐藥基因在21株對環(huán)丙沙星耐藥的香港海鷗型菌中只檢測出aac(6')-Ib-cr基因,其他的PMQR基因(qnrA、qnrB、qnrS、qnrC、qnrD和qepA)均未檢測出。aac(6')-Ib基因陽性株有11株,陽性率為52.38%(11/21);而aac(6')-Ib基因陽性株中有9株發(fā)生aac(6')-Ib-cr基因突變,突變率高達81.82%(9/11)。
　　結論：
　　1.香港海鷗型菌

12、能從淡水草魚和虎紋蛙中分離得到,且虎紋蛙中香港海鷗型菌的分離率高于草魚中的分離率。
　　2.在所檢測的5種喹諾酮類抗菌藥物中,香港海鷗型菌分離株對萘啶酮酸耐藥率最高,對左氧氟沙星耐藥率最低。魚分離株和蛙分離株的耐藥譜不同,蛙分離株對喹諾酮類藥物的耐藥情況比魚分離株嚴重。
　　3.香港海鷗型菌對喹諾酮類藥物耐藥的主要機制是靶位基因gyrA和parC基因多位點突變,gyrA基因的主要突變位點是T85I、D89N和D89G,而pa