SIN1通過調控上皮細胞間質轉化促進肝細胞癌侵襲轉移.pdf

1、原發(fā)性肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是世界上最為常見的惡性腫瘤之一。其發(fā)病率居男性惡性腫瘤的第五位，死亡率居男性惡性腫瘤第二位。全球每年新發(fā)病例約748300人，年死亡病例達695900人。隨著肝臟外科技術的進步，肝癌的手術治療水平已有顯著提高，但其術后5年復發(fā)轉移率仍高達70％，嚴重制約了肝癌患者整體治療水平的提高。因此，深入研究肝癌復發(fā)轉移的機制，探索有效的預防和治療復發(fā)轉移的手段是當今肝癌研究

2、的熱點，對于進一步提高肝癌患者整體治療水平具有十分重要的意義。
　　應激活化蛋白激酶作用蛋白1(SAPK interacting protein1，SIN1)新近發(fā)現(xiàn)的胚胎發(fā)育關鍵蛋白。SIN1被認定為TORC2關鍵組成成分，可通過調控AKT磷酸化影響AKT下游信號通路。眾所周知，AKT信號通路對包括肝癌在內的惡性腫瘤的侵襲轉移發(fā)揮著重要的作用，尤其是近年來大量研究發(fā)現(xiàn)AKT信號通路可以調控上皮細胞間質轉化，從而促進腫瘤轉移。這些

3、均提示SIN1很可能在肝癌的侵襲轉移中發(fā)揮重要作用。為此，本課題試圖研究SIN1在肝癌組織樣本及肝癌細胞系中表達水平，并結合隨訪資料，分析SIN1與肝癌臨床病例特征的關聯(lián)以及SIN1與肝癌患者生存預后的關系。我們利用siRNA干擾技術在肝癌細胞系中抑制SIN1的表達，從體外和體內研究SIN1對肝癌侵襲轉移的作用，并探討了SIN1對肝癌上皮細胞間質轉化的調控作用。以期闡明SIN1在肝癌侵襲轉移中的作用及其作用機制。我們的研究結果表明:

4、r>　　1.SIN1 mRNA和蛋白在肝癌組織和肝癌細胞系中顯著高表達首先我們通過實時定量PCR檢測了30對肝癌組織以及相應癌旁組織中SIN1 mRNA的表達水平，結果顯示SIN1 mRNA在肝癌組織中顯著高表達（中位值為2.2倍）。通過western blot檢測SIN1蛋白在肝癌組織以及相應癌旁組織中的表達，結果表明SIN1蛋白在肝癌組織中的表達水平顯著高于鄰近非癌肝組織（P＜0.05）。通過進一步分層分析我們發(fā)現(xiàn)，SIN1在孤立性

5、大肝癌(SLHCC)中的表達水平顯著低于結節(jié)性肝癌(NHCC)（P=0.016），而與小肝癌(SHCC)之間則沒有顯著差別（P＞0.05）。我們進一步采用real-time PCR和western blot檢測了SIN1 mRNA及蛋白在正常肝細胞系L02，以及五種不同的肝癌細胞系HepG2、MHCC97-L、MHCC97-H、HCCLM3和SMMC-7721中的表達水平。實驗結果顯示:SIN1在肝癌細胞系中的表達水平顯著高于正常肝細胞

6、系L02（P＜0.05），且SIN1在肝癌細胞系中的表達水平隨著各肝癌細胞系侵襲轉移潛能的增強而增高，提示SIN1與肝癌的侵襲轉移密切相關。同時，我們還選取了SIN1表達水平最高的HCCLM3和MHCC97-H細胞系作為下一步的研究對象。
　　2.SIN1表達水平與肝癌臨床病理特征及預后的關系通過免疫組化檢測SIN1在60對肝癌組織和相應癌旁組織中的表達，結果同樣表明其在肝癌組織呈顯著高表達，且SIN1高表達組的總體生存率和無瘤生

7、存率均顯著低于SIN1低表達組（P＜0.05），提示SIN1高表達組的肝癌病人預后較差。而且研究尚發(fā)現(xiàn)SIN1表達水平與腫瘤結節(jié)個數(shù)（P=0.012），包膜形成（P=0.037），血管浸潤（P=0.023），及TNM分期(P=0.020)密切相關。
　　3.SIN1在體外能顯著增強肝癌細胞的運動和侵襲能力為了研究SIN1在體外對肝癌細胞運動和侵襲能力的影響，我們首先構建了SIN1siRNA，通過慢病毒轉染SIN1相對高表達的HCC

8、LM3和MHCC97-H細胞系，采用western blot驗證SIN1 siRNA干擾效率。通過劃痕愈合實驗和Transwell侵襲小室實驗研究SIN1對肝癌細胞系HCCLM3和MHCC97-H侵襲運動能力的影響。劃痕愈合實驗結果顯示HCCLM3SIN1-RNAi遷移運動能力較HCCLM3NC細胞明顯減弱（95％ versus45％，P＜0.05）;Transwell實驗結果顯示HCCLM3SIN1-RNAi細胞侵襲能力較 HCCLM

9、3NC細胞明顯下降（161±18 versus56±13，P＜0.05）;同樣，在MHCC97-H細胞系中也得到了相似的結果(P＜0.05)。提示下調SIN1的表達可顯著抑制肝癌細胞的侵襲運動能力。
　　4.SIN1在體內能促進肝癌轉移為了研究SIN1在體內對肝癌侵襲轉移的作用，我們構建了人肝癌細胞裸鼠肝臟原位種植模型。我們選擇侵襲轉移潛能最強同時也是SIN1表達水平最高的細胞系HCCLM3來進行研究，結果顯示，HCCLM3SIN

10、1-RNAi組肝癌肝內轉移結節(jié)數(shù)目較HCCLM3NC組明顯減少(7±3 versus15±5，P＜0.05)，明顯提示降低SIN1表達水平可以明顯抑制肝癌在裸鼠體內的轉移。
　　5.SIN1調控上皮細胞間質轉化已有的研究表明SIN1是調控AKT磷酸化的關鍵蛋白，而大量研究證實AKT磷酸化對上皮細胞間質轉化發(fā)揮了非常重要的調控作用。由此，我們推測SIN1很可能通過調控AKT磷酸化參與了肝癌上皮細胞間質轉化，從而促進肝癌侵襲轉移。為此

11、，我們在HCCLM3和MHCC97-H兩個肝癌細胞系中開展了一系列研究。結果表明降低HCCLM3和MHCC97-H細胞系中SIN1的表達水平后AKT磷酸化明顯減少（P＜0.05）。而且上皮細胞間質轉化相關蛋白Snail，Vimentin，N-cadherin，MMP9的表達亦明顯減少（P＜0.05），而E-cadherin的表達則顯著增高（P＜0.05）。在HCCLM3SIN1-RNAi和MHC97-HSIN1-RNAi細胞中過表達Sn