siRNA介導(dǎo)的ClC-3基因沉默對(duì)H2O2誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、目的:觀察小干擾 RNA( small interfering RNA, siRNA)抑制氯離子通道蛋白3(voltage-dependent Cl channels-3, ClC-3)基因表達(dá)對(duì)大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞(rat pheochromocytoma cells, PC-12)細(xì)胞凋亡的影響,探討ClC-3在過(guò)氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)的PC-12凋亡中的作用機(jī)制。
　　方法:(1)PC-12細(xì)胞的傳代培養(yǎng)。(2)細(xì)胞計(jì)數(shù)

2、(Cell counting kit-8,CCK-8)試劑盒檢測(cè)不同濃度H2O2干預(yù)12h后,PC-12細(xì)胞生存率,確定構(gòu)建細(xì)胞凋亡模型所需H2O2的濃度。(3)采用處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC-12細(xì)胞,隨機(jī)分4組:正常對(duì)照組、模型組、空質(zhì)粒組、RNA干擾組,每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。其中正常對(duì)照組加高糖DMEM完全培養(yǎng)基;模型組加入H2O2干預(yù);空質(zhì)粒組為轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒后加H2O2干預(yù);RNA干擾組為轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒后加 H2O2干預(yù)。作用12小時(shí)后, CC

3、K-8檢測(cè)細(xì)胞生存率;Hochest33342染色細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察;Western Blot法檢測(cè)Caspase-3以及ClC-3蛋白的表達(dá);實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Caspase-3及ClC-3mRNA的表達(dá);流式細(xì)胞儀(Flow cytomet,FCM)進(jìn)行細(xì)胞凋亡率的檢測(cè)。
　　結(jié)果:(1)與0nmol/L模型組比較,50、100、200、300、400、500、600、700nmol/L模型組PC-12生存率降低(P<0.05

4、),且與H2O2濃度呈負(fù)相關(guān)(r=-0.961, P<0.05)。其中400nmol/L模型組細(xì)胞生存率為(49±1.20)％,采用此濃度建立 PC-12細(xì)胞凋亡的模型。(2)Hochest33342對(duì)細(xì)胞核染色顯示,與正常對(duì)照組比較,模型組、空質(zhì)粒組、RNA干擾組細(xì)胞生存率降低,凋亡率增高(P<0.05)。與模型組比較,空質(zhì)粒組細(xì)胞生存率、凋亡率無(wú)顯著變化(P>0.05),RNA干擾組細(xì)胞生存率增高,凋亡率降低( P<0.05)。與空

5、質(zhì)粒組比較, RNA干擾組細(xì)胞生存率增高,凋亡率降低(P<0.05)。(3)Western blot結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組比較,模型組和空質(zhì)粒組細(xì)胞Caspase-3和ClC-3蛋白表達(dá)增高;RNA干擾組細(xì)胞Caspase-3和ClC-3蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。與模型組比較,空質(zhì)粒組細(xì)胞Caspase-3和ClC-3蛋白表達(dá)無(wú)顯著差異(P>0.05);與空質(zhì)粒組比較,RNA干擾組細(xì)胞Caspase-3和ClC-3蛋白表達(dá)降低(P<

6、0.05)。(4)real-time PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組比較,模型和空質(zhì)粒組細(xì)胞Caspase-3和ClC-3mRNA表達(dá)增高;RNA干擾組細(xì)胞Caspase-3和ClC-3mRNA表達(dá)降低(P<0.05)。與模型組比較,空質(zhì)粒組細(xì)胞Caspase-3和ClC-3mRNA的表達(dá)無(wú)顯著差異(P>0.05);與空質(zhì)粒組比較,RNA干擾組細(xì)胞Caspase-3和ClC-3mRNA的表達(dá)降低(P<0.05)。(5)流式細(xì)胞技術(shù)顯示

7、;與正常對(duì)照組比較,模型組和空質(zhì)粒組細(xì)胞凋亡率顯著增高(P<0.05)。與模型組比較,空質(zhì)粒組細(xì)胞凋亡率無(wú)顯著差異(P>0.05)。與空質(zhì)粒組比較,RNA干擾組細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。
　　結(jié)論:(1)H2O2可通過(guò)提高Caspase-3表達(dá),激活凋亡信號(hào)通路,誘導(dǎo)PC-12發(fā)生凋亡。(2)沉默ClC-3基因,減少ClC-3表達(dá),抑制caspase-3介導(dǎo)的凋亡通路,會(huì)減少H2O2誘導(dǎo)的PC-12凋亡發(fā)生,說(shuō)明ClC-