腎綜合征出血熱患者不同臨床階段NK細胞及其相關表面標志物的研究.pdf

1、前言
　　腎綜合征出血熱(hemorrhagicfeverwithrenalsyndrome，HFRS)是由漢坦病毒引起的一種歷史悠久、流行廣泛、危害性嚴重的自然疫源性疾病。該病的主要臨床特征有發(fā)熱、出血和腎損害，其病理改變包括微血管出血、急性血小板減少、低血壓休克以及腎衰竭等。目前，我國HFRS的發(fā)病率和病死率仍居世界首位，是重災區(qū)。HFRS具有如此高的發(fā)病率及病死率，但發(fā)病機制尚未完全清楚。在漢坦病毒的感染中，免疫細胞及其表面

2、相關標志物的研究不容忽視。
　　病毒感染人體后能導致感染細胞功能和結構的損害，另一方面也能誘發(fā)人體的免疫應答和各種細胞因子的釋放。自然殺傷細胞是天然免疫系統(tǒng)的主要組成部分，免疫反應中可顯著地發(fā)揮抗病毒作用。NK細胞是一群CD3表達陰性、CD56表達陽性或CD16表達陽性的淋巴細胞，具有較強的殺傷功能和免疫調(diào)節(jié)功能。NK細胞表面受體包括殺傷抑制受體和活化受體。這些受體能夠與靶細胞表面相應的配體相結合而產(chǎn)生抑制信號或活化信號，決定著N

3、K細胞是否對靶細胞發(fā)揮殺傷功能。
　　CD8+T細胞是介導細胞免疫的效應T細胞，經(jīng)抗原致敏后可以特異性殺傷攜帶致敏抗原的靶細胞，通過其表面的受體TCR和CD8分子同抗原提呈細胞提呈的MHC-肽復合物結合從而傳導活化信號，進而對靶細胞進行殺傷。同時，有研究表明，CD8+T細胞也可表達一些抑制性或活化性的NK相關受體。但目前對于HFRS患者體內(nèi)CD8+T細胞表面NKR的表達情況，報道較少。
　　因此，本實驗對HFRS患者不同臨床

4、階段NK細胞亞群的精細劃分、特定NK細胞亞群表面受體的表達，HFRS患者體內(nèi)CD8+T表面NKR的表達情況進行深入研究，以期為闡明HFRS患者的免疫機制、尋找有效地疾病防御防控措施提供依據(jù)。
　　方法
　　一、實驗標本采集
　　按照2008年修訂的“全國流行性出血熱防治方案”(WS278-2008)中臨床診斷及分型標準，所有病例經(jīng)特異性HFRS—IgM、IgG檢查均為陽性，臨床表現(xiàn)典型。陰性的健康對照者來自健康體檢門診

5、和實驗室工作人員，血常規(guī)、肝、腎功能正常，無免疫系統(tǒng)疾病史。在患者知情并同意的情況下抽取外周血5ML肝素鈉抗凝。同時對健康人群以同樣的方法取血作對照。
　　二、淋巴細胞分離
　　1)取5ml抗凝全血與5mlPBS緩沖液，加入10ml人淋巴細胞分離液離心20分鐘，取中間白色云霧狀狹窄層（PBMC層），放入4-5mlPBS緩沖液的試管中，離心10分鐘。吸去上清液，沉淀經(jīng)過反復洗滌2次即得所需淋巴細胞。
　　2)將分離淋巴細

6、胞置于液氮罐中保存以備后續(xù)分析。
　　三、細胞復蘇
　　從液氮保存罐中取出凍存管，立即放入40度水浴中，快速搖晃，直至凍存液完全融化，將細胞懸液移入離心管中，緩慢加入1640培養(yǎng)液，離心兩次，去除二甲基亞砜。
　　四、細胞表面染色
　　向流式細胞儀專用試管中加入0.1mlPBMC懸液，按照BD公司細胞表面染色試劑盒說明書操作分別加入相應的抗體，并設立單標管與陰性對照管。染色半個小時后加每管加入2mlPBS緩沖液進

7、行洗滌，離心10分鐘，用緩沖液重懸細胞，流式細胞儀進行檢測。
　　五、流式細胞檢測
　　為保證實驗準確性，檢測機器的準確性，然后再對之前制備好的樣本進行測定，用流式分析軟件對數(shù)據(jù)進行分析。
　　六、統(tǒng)計學分析
　　使用SPSS11.0統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計。樣本采用獨立樣本t檢驗對數(shù)據(jù)做統(tǒng)計分析。
　　實驗結果
　　一、HFRS患者NK細胞變化
　　HFRS患者的NK細胞水平明顯高于正常對照組，并

8、且具有統(tǒng)計學差異。對四個不同臨床發(fā)病階段的患者同正常對照組進行比較分析發(fā)現(xiàn)，在四個發(fā)病階段內(nèi)兩種細胞水平也都處于升高狀態(tài)，且少尿期高于發(fā)病初期與末期。
　　二、HFRS患者NK細胞活化與抑制受體表達變化
　　對NK細胞抑制受體NKG2A和活化受體NKG2D進行了分析。結果患者抑制受體NKG2A表達總水平有下降趨勢，并且在少尿期下降的比較明顯。但是NK細胞活化受體NKG2D表達有上升的趨勢。對不同發(fā)病階段患者活化受體表達進行比

9、較發(fā)現(xiàn)少尿期略有升高。
　　三、HFRS患者NK細胞亞群變化
　　對HFRS患者NK細胞的3個NK細胞亞群進行檢測，發(fā)現(xiàn)所有患者的CD56-CD16+和CD56briCD16-/+NK亞群細胞數(shù)量顯著高于正常對照組，并且在都少尿期升高明顯，而CD56dimCD16+細胞NK亞群沒有明顯的變化。對各期變化趨勢進行分析時，結果同樣是沒有差異。
　　四、HFRS患者CD8+T細胞以及其表面表達NK受體的變化
　　首先選

10、取標記CD3+的T淋巴細胞，再定義出CD3+CD8+T細胞，結果為患者CD8+T細胞整體水平顯著升高，整個病程中的CD8+T細胞水平升高的都很明顯。但是HFRS患者與正常對照CD8+T細胞表達NK受體(活化受體NKG2D和抑制受體NKG2A)并沒有太大的差異。
　　結論
　　HFRS患者NK細胞數(shù)量在疾病的發(fā)熱期和少尿期顯著增加。NK細胞活化受體NKG2D表達量總體水平上升，抑制受體NKG2A表達下降，在少尿期最少。NK細胞