倍他環(huán)糊精修飾的載阿霉素聚合物膠束的構(gòu)建及抗腫瘤作用研究.pdf

1、臨床上用于抗腫瘤治療的許多藥物由于溶解性能較差，毒副作用嚴重以及使用過程中腫瘤細胞對化療藥物產(chǎn)生的多藥耐藥而導致其應用受到很大的限制，新型藥物傳遞系統(tǒng)的開發(fā)為提高藥物抗腫瘤效果提供了新的思路。本文主要研究內(nèi)容是通過兩親聚合物膠束結(jié)合β-環(huán)糊精(β-CD)對疏水性藥物的包合作用，構(gòu)建新型藥物膠束傳遞系統(tǒng)，提高對疏水性藥物的包載能力，達到逆轉(zhuǎn)耐藥效果。β-CD擁有眾多羥基，能夠進行化學修飾，我們選擇在其伯羥基位上鏈接兩親性的聚合物鏈，從而得

2、到兩親性環(huán)糊精聚合物，在此基礎上修飾葉酸小分子靶向基團，優(yōu)化載體結(jié)構(gòu)，獲得具有腫瘤主動靶向能力以及具有良好耐藥逆轉(zhuǎn)作用的給藥系統(tǒng)，通過對構(gòu)建的膠束載藥系統(tǒng)逆轉(zhuǎn)耐藥機制的深入研究，為提高抗腫瘤藥物化療效果提供新平臺和新思路。本研究主要內(nèi)容包括：
　?、乓跃垡叶紗渭酌?mPEG)為親水鏈，聚乳酸(PLA)或聚己內(nèi)酯(PCL)為疏水鏈合成兩嵌段共聚物，與β-CD伯羥基位相連得到基于β-CD的兩親性聚合物膠束聚乙二醇-聚乳酸-環(huán)糊精(P

3、ELA-CD)或聚乙二醇-聚己內(nèi)酯-環(huán)糊精(PECL-CD)。表征合成得到的聚合物，考察其在水溶液中的膠束化行為，聚合物膠束粒徑分布在100～200nm左右，CMC值在0.0016～0.01g/L之間。
　?、埔钥鼓[瘤藥物阿霉素為模型藥物一，用乳化溶劑揮發(fā)法獲得載藥的聚合物膠束。比較β-CD、PEG-CD、PELA、PELA-CD膠束的載藥情況，所合成的PELA-CD、PECL-CD膠束載藥量普遍高于β-CD、PEG-CD、PEL

4、A，其中PELA54-CD、PECL54-CD的載藥量最大，說明β-CD經(jīng)聚合物修飾改性后更利于負載DOX。PLA疏水鏈段的加入，使得膠束結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，與β-CD的疏水區(qū)域共同增加對疏水性阿霉素的包載。包載阿霉素后膠束的粒徑主要集中在100～160nm之間，并且具有較窄的分布。載藥膠束內(nèi)DOX的釋放具有一定的特點性，即在pH7.4的生理條件下釋放緩慢，而在pH5.5的酸性條件下釋放加快，有利于膠束在腫瘤部位發(fā)揮細胞毒性作用。以多烯紫杉醇

5、為模型藥物二，建立了DTX的測定方法，其精密度高，系統(tǒng)適應性符合要求。通過考察不同載藥方法得到的膠束載藥量、粒徑等指標，發(fā)現(xiàn)薄膜水化法操作簡便，易控制藥物濃度，且得到的膠束包封率高、粒徑在80～120 nm，透射電鏡觀察膠束形態(tài)，形狀規(guī)整成球形?？疾觳煌杷湺伪壤腜ELA-CD對載藥量的影響，當親疏水鏈段比例為5∶4時膠束具有最大載藥量和包封率。連接β-CD之后的膠束載藥量與PELA膠束相比并無明顯的提高，因此，無需通過環(huán)糊精來改善

6、兩嵌段聚合物膠束對DTX的包載性能。以上結(jié)果表明構(gòu)建的基于β-CD的聚合物膠束體系可廣泛應用于疏水性藥物的包載。
　?、窃赑EG-PLA-β-CD的基礎上，引入小分子葉酸(FA)，構(gòu)建同時具有主動和被動靶向作用的聚合物載阿霉素體系FA-PELA-CD/DOX。PLA疏水鏈段與β-環(huán)糊精的疏水區(qū)域共同增加對疏水性阿霉素的包載，葉酸修飾并未改變藥物釋放特性。在高表達葉酸受體的HeLa細胞上，藥物攝取明顯增多，對腫瘤細胞的毒性也顯著增強

7、。PEG修飾，延長了體循環(huán)時間，EPR效應增強被動靶向作用以及腫瘤部位藥物滯留時間，近紅外成像實驗顯示葉酸膠束給藥10天后腫瘤部位仍具有最高的藥物量。腫瘤組織切片結(jié)果顯示與游離藥物組相比，聚合物膠束組可以造成腫瘤細胞的不可避免的以及時間依賴性的損傷。葉酸修飾使聚合物膠束具有主動靶向作用，在增強載藥膠束系統(tǒng)對腫瘤細胞毒性的同時能夠減少對心臟的毒副作用。上述機制的共同作用最終實現(xiàn)了FA-PELA-CD/DOX對裸鼠KB細胞移植瘤86％的抑制

8、效果。
　?、润w外細胞毒性、細胞凋亡實驗以及斑馬魚體內(nèi)抑瘤實驗發(fā)現(xiàn)載藥膠束PELA-CD/DOX和PECL-CD/DOX可以增強DOX對MCF-7/ADR細胞的毒性。體外細胞毒性結(jié)果顯示載藥聚合物膠束PELA54-CD/DOX的耐藥逆轉(zhuǎn)倍數(shù)達到了8.82倍，PEG、PLA或PCL與β-CD的結(jié)合能夠顯著增強耐藥逆轉(zhuǎn)效果。此外載藥聚合物膠束PELA54-CD/DOX對斑馬魚體內(nèi)MCF-7/ADR腫瘤的抑制取得了很好的效果，高劑量組腫

9、瘤抑制率達到64％，同時載藥膠束緩解了阿霉素的心臟毒性。體外細胞對P-gp底物R123的攝取實驗與斑馬魚體內(nèi)羅丹明B滯留實驗均表明PELA-CD和PECL-CD膠束可以提高P-gp底物在MCF-7/ADR細胞內(nèi)的滯留，減少P-gp對底物的外排。通過ATP耗竭實驗、ATP酶活性實驗、LDH檢測、細胞內(nèi)活性氧和線粒體膜電位檢測、細胞P-gp蛋白和MDR1基因表達檢測等系列實驗發(fā)現(xiàn)聚合物膠束逆轉(zhuǎn)P-gp的作用機制為:通過耗竭細胞內(nèi)ATP、減少

10、細胞P糖蛋白的表達以及作為底物競爭性結(jié)合P-gp從而減少抗腫瘤藥物的外排，最終實現(xiàn)耐藥逆轉(zhuǎn)。聚合物分子中三個組分對阿霉素的構(gòu)效關系具有重要的影響。
　　⑸本研究構(gòu)建了基于β-CD的聚合物膠束藥物傳遞體系，能夠提高對疏水性藥物的包載能力;利用FA對膠束進行修飾，使之具有腫瘤主動靶向性，增強抑瘤效果的同時減少了DOX的毒副作用;通過相關實驗總結(jié)聚合物膠束PELA-CD逆轉(zhuǎn)P-gp介導的耐藥機制，建立了一套較為完整的P-gp作用機制的評