組蛋白去甲基化酶PHF8對壓力負荷誘導的心肌肥厚的抑制作用.pdf

1、哺乳動物的心臟在壓力負荷增加的情況下會發(fā)生心肌肥厚，以適應增加的工作負荷，持續(xù)的心肌肥厚會導致心臟功能失代償，隨后發(fā)生心衰。心肌肥厚的主要病理表現(xiàn)有心肌細胞肥大、心肌細胞外基質重建、心肌間質增殖等。心肌細胞蛋白合成增加，可導致心肌細胞體積增大，即心肌細胞肥大。研究證實，心肌細胞肥大的形成需要刺激信號、信號傳導、細胞核內基因轉錄活化以及心肌表型轉化等四個環(huán)節(jié)，其最終效應是心肌表型由“成熟型”向“胚胎型”轉化。對于心肌肥厚的機制已有諸多研究

2、，但其具體發(fā)生機制仍未明確，因而尚沒有可以確切有效預防心肌肥厚的方法。目前研究證實，在心肌肥厚的過程中，一組通常在胎兒心臟發(fā)育過程中表達的基因被重新表達，參與了心肌肥厚的病理調控。
　　組蛋白是真核生物染色質的組成部分，組蛋白亞基的氨基端游離稱為組蛋白尾巴，組蛋白尾巴上的許多殘基可以被共價修飾，不同殘基的不同修飾可以產生各種不同的信號，由其他信號蛋白識別，從而可調控真核生物的基因表達，導致轉錄激活或基因沉默，進而產生多種生物學效應

3、。已有研究表明，組蛋白修飾與多種疾病的發(fā)病密切相關。如慢性腎臟病、腫瘤性疾病、神經系統(tǒng)疾病、內分泌系統(tǒng)疾病等，在心血管領域，組蛋白修飾也發(fā)揮了重要作用。
　　PHD鋅指蛋白8(PHF8)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種組蛋白去甲基化酶，可在體內通過對組蛋白的賴氨酸殘基進行去甲基化修飾來調節(jié)基因的表達。PHF8是組蛋白去甲基化酶JmjC家族中的一個成員，JmjC家族成員在正常的個體發(fā)育、分化、內分泌的調節(jié)及多種疾病的發(fā)生發(fā)展中參與重要的調節(jié)作用

4、。PHF8作為JmjC家族中的一員，它可以特異性去除抑制性組蛋白標記H4K20me1和H3K9me1/2，而結合活性組蛋白標志H3K4me3，在組蛋白修飾中發(fā)揮重要作用并參與發(fā)育調節(jié)及多種疾病的發(fā)生發(fā)展。但PHF8在心血管系統(tǒng)尤其心肌肥厚中的作用尚不明確。
　　目的：
　　本課題將從體內和體外兩個部分設計試驗，旨在探討PHF8在心肌肥厚發(fā)病中的作用，并初步探討其作用的分子生物學機制，從而為防治心肌肥厚尋找新的契機和治療靶點。

5、
　　方法：
　　1.轉基因動物模型的建立:
　　構建心臟特異性人PHF8基因轉基因（PHF8-Tg）小鼠。
　　2.心肌肥厚動物模型的建立:
　　通過主動脈縮窄術(TAC)建立壓力負荷誘導的心肌肥厚小鼠模型。
　　3.小鼠超聲心動圖:
　　小鼠心臟超聲檢測小鼠心臟結構和功能。
　　4.細胞培養(yǎng)及模型建立:
　　提取原代新生大鼠心肌細胞(NRMCs)并培養(yǎng)，體外以苯腎上腺素(PE)等

6、刺激誘導NRMCs發(fā)生肥大性生長反應。
　　5.細胞內PHF8干預:
　　采用腺病毒載體轉染的方式干預NRMCs中PHF8的表達。
　　6.HE染色、麥胚凝集素染色、Masson染色:
　　分別顯示心肌的大體結構、心肌細胞大小及心肌纖維化程度。
　　7.免疫印跡:
　　用于在蛋白水平檢測組織和細胞中PHF8、ANP及相關信號通路蛋白的表達變化。
　　8.RT-PCR:
　　用于在基因水平檢

7、測組織和細胞中PHF8、ANP、β-MHC、BNP及相關信號通路mRNA水平的變化。
　　9.3H-亮氨酸摻入試驗:
　　用于檢測心肌細胞中蛋白質合成水平。
　　10.熒光酶活性檢測:
　　用于檢測心肌細胞中胚胎基因的啟動子活性。
　　11.免疫熒光分析:用于檢測心肌細胞的大小。
　　結果：
　　1.病理性心肌肥厚下調PHF8水平:
　　在TAC手術后4周野生型C57BL/6小鼠的心肌中，

8、PHF8的表達顯著下降，在PE刺激的肥大性生長的NRMCs中，我們得到了相似的結論。這些研究結果表明PHF8可能參與了心肌細胞病理性肥大的過程。
　　2.PHF8過表達抑制壓力負荷下的心肌重構:
　　接受TAC術4周后，PHF8-Tg小鼠的心功能顯著優(yōu)于野生型(wT)小鼠，左心室纖維化面積相比WT小鼠顯著減小，纖維化標記物(COL1A1，COL3A1，CTGF，TGFβ1，纖連蛋白和α-SMA)和肥厚性胎兒基因(ANP，BN

9、P，β-MHC，ACTA1和IL-6)的表達在PHF8-Tg小鼠也顯著下調，這些結果表明，PHF8可抑制壓力負荷誘導的病理性心肌重構。
　　3.PHF8調節(jié)NRMCs肥厚性生長:
　　PHF8過表達可抑制PE誘導的肥厚性胎兒基因表達并下調其啟動子活性，而PHF8敲除則促進PE誘導的肥厚性胎兒基因表達并上調其啟動子活性。研究結果表明，PHF8在體外負向調節(jié)心肌細胞肥大反應。
　　4.PHF8調節(jié)AKT-mTOR信號通路:

10、
　　PHF8過表達顯著降低TAC誘導的Akt和mTOR的磷酸化，這表明PHF8過表達阻斷TAC誘導的Akt-mTOR信號通路。敲除PHF8則促進了PE誘導的AKT-mTOR途徑的激活。
　　5.雷帕霉素可修復PHF8表型缺失:
　　我們發(fā)現(xiàn)雷帕霉素抑制PE誘導的NRCMs肥大性生長，也抑制PE誘導的ANP和β-MHC的蛋白質合成和啟動子活化，并且PHF8敲除誘導的ANP和β-MHC蛋白質合成和增生性基因表達的上調被完

11、全阻斷。因此，雷帕霉素可修復PHF8表型缺陷。
　　結論：
　　1.PHF8能抑制壓力負荷下心肌重塑及心肌細胞肥大性生長;
　　2.PHF8抑制心肌細胞肥大性生長的作用可能是通過AKT-mTOR信號通路實現(xiàn)的;
　　3.PHF8可能起到類似雷帕霉素抗心肌肥厚的作用。
　　4.在本實驗研究中，我們分別在體內及體外水平研究了PHF8對心肌肥厚的抑制作用，并初步探討了其作用的分子生物學機制，以期為臨床防治心肌肥厚