脲原體拓?fù)洚悩?gòu)酶基因突變與喹諾酮類耐藥的相關(guān)性研究.pdf

1、脲原體包括微小脲原體（Ureaplasma parvum,Up）和解脲脲原體(Ureaplasma urealyticum,Uu),是引起人類非淋球菌性生殖道感染的主要支原體類病原體之一。由于脲原體缺乏細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，故阻礙細(xì)胞壁合成的抗生素如青霉素類、頭孢菌素類等對(duì)脲原體感染天然無(wú)效。四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類及喹諾酮類抗生素是治療脲原體感染的主要有效藥物。由于抗生素的大量使用及使用不當(dāng)，脲原體的耐藥現(xiàn)象日趨嚴(yán)重，尤其對(duì)喹諾酮類氧氟沙星和環(huán)丙沙

2、星的耐藥率分別已高達(dá)30％和60％多，久治不愈的病例屢見(jiàn)不鮮，國(guó)內(nèi)外對(duì)其耐藥機(jī)制研究亦逐漸增多.對(duì)喹諾酮類耐藥的機(jī)制主要與編碼拓?fù)洚悩?gòu)酶II（gyrA/gyrB）和拓?fù)洚悩?gòu)酶IV(parC/parE)亞單位的基因突變有關(guān)。但目前國(guó)內(nèi)外對(duì)脲原體的耐藥判斷都缺乏一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化的研究方法，這就阻礙了脲原體耐藥株的準(zhǔn)確判斷，以及后續(xù)抗生素耐藥情況和基因突變結(jié)果之間的相關(guān)性比較。
　　 本研究在Beeton等研究方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行改良，在96孔

3、板上利用微量肉湯稀釋法對(duì)樣本中脲原體菌量和對(duì)喹諾酮類藥物的MIC用斷裂點(diǎn)分析法同時(shí)進(jìn)行測(cè)定，確定真正的脲原體喹諾酮類耐藥株。收集瑞金醫(yī)院2009.7-12月的門診非淋球菌性尿道炎患者泌尿生殖道標(biāo)本435例，隨機(jī)測(cè)定了66份樣本脲原體的精確MIC，同時(shí)對(duì)脲原體陽(yáng)性株產(chǎn)物進(jìn)行基因組提取、PCR擴(kuò)增喹諾酮類耐藥基因gyrA、gyrB、parC和parE，測(cè)序并和NCBI基因庫(kù)中標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行比對(duì)，以發(fā)現(xiàn)新的耐藥基因突變位點(diǎn)及本地區(qū)耐藥菌株流行趨

4、勢(shì)，以圖進(jìn)一步闡明脲原體對(duì)喹諾酮類耐藥的作用機(jī)制。首先，通過(guò)改良棋盤稀釋法測(cè)定66份樣本的MIC發(fā)現(xiàn)，和臨床上常用的梅里埃的IST2脲原體試劑盒（下面簡(jiǎn)稱藥敏卡法）相比，在棋盤稀釋法確定的環(huán)丙沙星、氧氟沙星敏感的解脲脲原體中，藥敏卡法分別將50％（5/10）和48.1％（13/27）的敏感菌株判為中介/耐藥；而在棋盤稀釋法確定的環(huán)丙沙星耐藥的菌株中，藥敏卡法將4.4％（2/45）的菌株判為敏感。另外，通過(guò)擴(kuò)增脲原體陽(yáng)性株的喹諾酮類耐藥基

5、因gyrA、gyrB、parC和parE,測(cè)序并與基因庫(kù)中標(biāo)準(zhǔn)株比對(duì)發(fā)現(xiàn)：⑴49份耐藥標(biāo)本中，僅15號(hào)一例出現(xiàn)有意義的gyrA突變，即M109K，突變率2.04％（1/49）。⑵26份出現(xiàn)parC突變，突變率53.06％（26/49）。其中23份均出現(xiàn)S83L 的突變，與國(guó)內(nèi)外報(bào)道一致，突變率為46.94％（23/49）；新發(fā)現(xiàn)了R68P、M89I、A117G突變。⑶有3份發(fā)生了parE突變，突變率6.12％（3/49）。分別是A457

6、T、E467K和R448K、G476R。⑷10份中介標(biāo)本中有一份發(fā)生了parC的S83L突變，突變率為10％（1/10）。⑸10份中介標(biāo)本中7份發(fā)生了gyrA基因D112E變異，1份敏感標(biāo)本也發(fā)生gyrA基因D112E的變異；另外49份耐藥標(biāo)本中也有38份發(fā)生D112E的變異，這個(gè)變異在以前被認(rèn)為與喹諾酮類耐藥高度相關(guān)，但Beeton認(rèn)為D112E只是非耐藥相關(guān)的種屬特異的多態(tài)性表現(xiàn)，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了這個(gè)結(jié)論。⑹60份標(biāo)本中除了1