應(yīng)激性反應(yīng)原作用于MicroRNA與CD44之間表達平衡進而影響胃癌干細胞的表型形成的初步研究.pdf

1、腫瘤干細胞假說認為腫瘤中存在一小部分亞群細胞，其生長特性類似與正常干細胞，具有自我更新，維持腫瘤生長和保持腫瘤異質(zhì)性的能力。雖然該理論遠未成熟，而且還存有諸多科學(xué)問題亟待解決，但經(jīng)過學(xué)者們不懈努力，越來越多的證據(jù)和實驗結(jié)果均證實了腫瘤干細胞的存在。2009年，Takaishi等從胃癌細胞系中分離得到了CD44表達陽性的細胞亞群，這些CD44+細胞具有腫瘤干細胞自我更新和腫瘤異質(zhì)性的能力，還能夠?qū)?、放療誘導(dǎo)的細胞程序性凋亡產(chǎn)生抵抗作用。

2、
　　 目的：選擇CD44作為分離標記，研究其在胃癌原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶組織內(nèi)的表達，通過酶消化聯(lián)合化療藥物篩選法分離胃癌干細胞，并對原代分離培養(yǎng)的胃癌干細胞的表型進行檢測。以MicroRNA和CD44之間表達平衡為突破口，研究應(yīng)激性反應(yīng)原如何作用與這兩者之間平衡影響干細胞的表型形成，為進一步從新的角度揭示胃癌發(fā)生發(fā)展的可能分子機制，并針對腫瘤干細胞為靶點，為開辟早期診斷、治療胃癌的新途徑奠定方法和理論基礎(chǔ)。
　　 方法：所有

3、細胞培養(yǎng)均使用10％胎牛血清，加入配好的抗生素液體中（青/鏈霉素100U/mL、100μg/mL）。細胞表型檢測使用流式細胞儀（BD FAcscalibur）分選，未加熒光標記一抗的腫瘤細胞作為空白對照。western blot檢測CD44、Lin28在胃癌原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶的表達。半定量RT-PCR及實時定量PCR檢測miR-373的表達，雙螢光素酶檢測分析STAT3和AP-1表達水平，實時定量PCR檢測異丙腎上腺素處理后胃癌細胞系表面標

4、記Rex-1和Nanog表達，Western blot結(jié)果表明β-腎上腺素受體在胃癌原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶表達。
　　 結(jié)果：雖然胃癌原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶內(nèi)均存在著CD44+亞群細胞，但是相比原發(fā)灶，轉(zhuǎn)移灶內(nèi)CD44+亞群細胞的比例顯著上調(diào)（約30倍）。Western blot檢測從蛋白水平上證實了CD44、Lin28在胃癌原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶組織內(nèi)存在著表達差異?；熕幬锖Y選培養(yǎng)結(jié)果顯示，CD44+亞群細胞能夠?qū)W沙利鉑產(chǎn)生抵抗，并且能夠逃避奧沙

5、利鉑誘導(dǎo)產(chǎn)生的細胞程序性死亡。篩選培養(yǎng)后CD44+細胞不但具有強大的分離增殖能力，而且能夠在體外培養(yǎng)形成球體克隆。
　　 miR-373在胃癌原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶組織存在表達差異。miR-373在原發(fā)灶內(nèi)表達的量遠遠高于其在轉(zhuǎn)移灶內(nèi)的表達量。miR-373可能通過正向調(diào)控E-cadherin影響EMT，從而影響腫瘤細胞的侵襲能力。miR-373能夠在體內(nèi)和體外抑制CD44的表達，影響胃癌干細胞的表型轉(zhuǎn)化。miR-373的啟動子區(qū)域含有

6、STAT3和AP-1結(jié)合位點，其上游信號通路活化后，通過激活STAT3信號通路和JNK/SAPK信號通路，抑制miR-373的功能，間接地促進CD44的表達，使細胞表型向胃癌干細胞的方向發(fā)生偏移。應(yīng)激性反應(yīng)原與其受體結(jié)合后，激活β腎上腺素受體-cAMP-PKA信號通路，從而上調(diào)STAT3和c-Jun的表達水平，影響miR-373的剪切及成熟，間接地抑制CD44的表達及胃癌干細胞的表型形成。
　　 結(jié)論：轉(zhuǎn)移灶內(nèi)CD44+亞群細胞