血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)心肌肥大的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激機(jī)制研究.pdf

1、心肌肥大是由缺血、機(jī)械牽張、激素和細(xì)胞因子等因素引起的心肌細(xì)胞代償性反應(yīng)，主要表現(xiàn)為細(xì)胞體積增大、重量增加以及間質(zhì)細(xì)胞增生，其過(guò)程中必然伴隨著鈣穩(wěn)態(tài)的失衡、蛋白質(zhì)合成速率增加以及細(xì)胞凋亡。心肌肥大失代償時(shí)出現(xiàn)心力衰竭，嚴(yán)重危及人類(lèi)生命。因此闡明心肌肥大的發(fā)病機(jī)制具有重要的臨床意義。
　　 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmicreticulum，ER)是細(xì)胞內(nèi)重要的亞細(xì)胞器，參與蛋白質(zhì)合成、折疊、鈣的儲(chǔ)存和釋放，還參與脂類(lèi)代謝、類(lèi)固醇代

2、謝的合成，對(duì)維持心肌細(xì)胞鈣離子和蛋白質(zhì)合成穩(wěn)態(tài)具有重要作用。缺血缺氧、葡萄糖/營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)匱乏、ATP耗竭、大量自由基的產(chǎn)生及Ca2+穩(wěn)態(tài)破壞等應(yīng)激刺激均可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能障礙，觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERstress，ERS)。適度的ER應(yīng)激有利于細(xì)胞內(nèi)鈣和蛋白質(zhì)加工等穩(wěn)態(tài)的恢復(fù)，增強(qiáng)細(xì)胞耐受應(yīng)激刺激的能力;持續(xù)而嚴(yán)重的ER應(yīng)激則促進(jìn)CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-bindingprotein-homologous

3、protein，CHOP)和Caspase-12等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡通路激活，觸發(fā)ER應(yīng)激相關(guān)的凋亡信號(hào)通路，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。ER應(yīng)激感受蛋白——蛋白激酶R樣ER激酶(proteinkinaseR-likeERkinase，PERK)是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的Ⅰ型跨膜蛋白激酶。正常狀態(tài)下，PERK與GRP78結(jié)合成無(wú)活性的復(fù)合物;當(dāng)發(fā)生ER應(yīng)激時(shí)，GRP78與未折疊蛋白或錯(cuò)誤折疊蛋白結(jié)合，同時(shí)與PERK解離，使其寡聚化并激活，進(jìn)而磷酸化真核細(xì)胞起始因子2

4、α(eukaryoticinitiationfactor2α，eIF2α)，下調(diào)mRNA和蛋白的轉(zhuǎn)錄翻譯水平，減輕ER蛋白負(fù)荷。持續(xù)的激活PERK/eIF2α信號(hào)通路將上調(diào)CHOP的轉(zhuǎn)錄翻譯水平，最終引起細(xì)胞凋亡，是介導(dǎo)ER應(yīng)激整合調(diào)控反應(yīng)的重要細(xì)胞內(nèi)信號(hào)途徑之一。
　　 既往研究證實(shí)ER應(yīng)激與心血管疾病、神經(jīng)退行性變、糖尿病和缺血/再灌注損傷等多種疾病密切相關(guān)。研究證實(shí)心肌肥大時(shí)ER應(yīng)激標(biāo)志性分子葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(gluco

5、se-regulatedprotein78，GRP78)、鈣網(wǎng)蛋白(calreticulin，CRT)表達(dá)明顯上調(diào)，提示ER應(yīng)激參與了心肌肥大的過(guò)程。本課題組前期研究證實(shí)，ER應(yīng)激誘導(dǎo)劑毒胡蘿卜素(thapsigargin，TG，抑制ER鈣泵繼而排空ER內(nèi)Ca2+)和衣霉素（tunicamycin，TM，抑制ER內(nèi)蛋白質(zhì)N-端糖基化）不僅可以誘導(dǎo)心肌細(xì)胞發(fā)生顯著的ER應(yīng)激，并直接誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大。牛磺酸(Taurine，Tau)是體內(nèi)含

6、量最豐富的含硫自由氨基酸，具有穩(wěn)定細(xì)胞膜、調(diào)節(jié)細(xì)胞Ca2+穩(wěn)態(tài)和清除氧自由基等多種生物學(xué)效應(yīng)。研究證實(shí)?；撬峥梢砸种艸cy等多種因素誘導(dǎo)的ER應(yīng)激，增強(qiáng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)折疊能力并且減少修飾異常，對(duì)心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用。血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）是一類(lèi)可以引起劇烈縮血管效應(yīng)的活性多肽是目前最常用的誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性心肌細(xì)胞肥大的物質(zhì)之一，其致心肌細(xì)胞肥大的機(jī)制尚未完全闡明，我們認(rèn)為PERK介導(dǎo)的ERS可能是AngⅡ致心肌細(xì)胞

7、肥大的機(jī)制。
　　 本工作在原代培養(yǎng)的乳大鼠心肌細(xì)胞AngⅡ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大模型上，研究ERS應(yīng)激分子GRP78、CRT以及PERK途徑相關(guān)分子表達(dá)的變化，進(jìn)一步研究?jī)?nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑牛磺酸對(duì)于AngⅡ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大以及該過(guò)程中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響。主要實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果如下:
　　 1血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大
　　 本部分實(shí)驗(yàn)在原代乳鼠心肌細(xì)胞模型上，觀察AngⅡ和ER應(yīng)激誘導(dǎo)劑對(duì)心肌細(xì)胞肥大的影響。采用不同濃度A

8、ngⅡ（10-7mmol/L、10-6mmol/L、10-5mmol/L）作用于心肌細(xì)胞48h;同時(shí)采用不同濃度TG（10nmol/L、50nmol/L、100nmol/L）作用于心肌細(xì)胞48h;另外采用不同濃度TM（1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml）作用于心肌細(xì)胞72h。采用RT-PCR技術(shù)觀察心肌細(xì)胞肥大標(biāo)志性基因心房鈉尿肽（atrialnatriureticpeptide,ANP）和腦鈉肽(brainnatriure

9、ticpeptide，BNP)mRNA表達(dá)，[3H]-亮氨酸([3H]-Leucine)摻入技術(shù)測(cè)定心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)合成速率，分析心肌細(xì)胞表面積變化，同時(shí)分析細(xì)胞凋亡率變化。
　　 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，10-7mmol/LAngⅡ組、50nMTG組和10ng/mlTM組誘導(dǎo)ANP和BNPmRNA表達(dá)顯著上調(diào)，蛋白質(zhì)合成速率和細(xì)胞表面積明顯增加，并且心肌細(xì)胞凋亡率較低。上述結(jié)果提示AngⅡ和ER應(yīng)激誘導(dǎo)劑可以誘導(dǎo)原代乳鼠心肌細(xì)胞發(fā)生顯著肥大。

10、
　　 2血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大過(guò)程中ERS相關(guān)分子表達(dá)變化
　　 CRT、GRP78是ER應(yīng)激的標(biāo)志性分子，而PERK/eIF2α信號(hào)途徑是ER應(yīng)激的重要信號(hào)通路之一。本部分實(shí)驗(yàn)在原代乳鼠心肌細(xì)胞肥大模型上，通過(guò)檢測(cè)AngⅡ和ER應(yīng)激誘導(dǎo)劑對(duì)心肌細(xì)胞ER應(yīng)激相關(guān)分子表達(dá)的影響，探討PERK介導(dǎo)的ERS在AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大過(guò)程中的作用。采用10-7mmol/LAngⅡ作用于心肌細(xì)胞48h、50nMTG作用于

11、心肌細(xì)胞48h以及10ng/mlTM作用于心肌細(xì)胞72h。分別采用RT-PCR和qPCR技術(shù)檢測(cè)ER應(yīng)激相關(guān)分子CRT、GRP78、PERK、eIF2α和CHOPmRNA表達(dá)，Westernblot技術(shù)檢測(cè)CRT、GRP78、PERK、eIF2α和CHOP蛋白水平改變。
　　 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AngⅡ組、TG組和TM組CRT、GRP78、PERK、eIF2α和CHOPmRNA和蛋白水平表達(dá)明顯增加，提示AngⅡ和ER應(yīng)激誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)心肌

12、細(xì)胞發(fā)生明顯ER應(yīng)激，并且PERK/eIF2α信號(hào)途徑參與了心肌細(xì)胞的肥大過(guò)程。證實(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的重要機(jī)制之一。
　　 3?；撬嵬ㄟ^(guò)抑制ERS減輕血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大
　　 上述研究結(jié)果表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的重要機(jī)制之一，既往研究表明牛磺酸(Taurine，Tau)可以對(duì)心肌缺血、心力衰竭、心肌缺血再灌注損傷及心律失常起保護(hù)作用。本部分實(shí)驗(yàn)在原代乳鼠肥大心肌細(xì)胞

13、肥大模型上，研究?；撬釋?duì)AngⅡ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大過(guò)程中ERS分子的變化及其與心肌細(xì)胞肥大的關(guān)系。在AngⅡ、TG、TM誘導(dǎo)的肥大心肌細(xì)胞模型組中分別加入40mMTau作為牛磺酸保護(hù)組。采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)ANP和BNPmRNA表達(dá)，[3H]-亮氨酸摻入技術(shù)測(cè)定心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)合成速率，同時(shí)分析心肌細(xì)胞表面積變化。采用RT-PCR和qPCR技術(shù)檢測(cè)ER應(yīng)激相關(guān)分子CRT、GRP78、PERK、eIF2α和CHOPmRNA表達(dá)，Weste

14、rnblot技術(shù)檢測(cè)CRT、GRP78、PERK、eIF2α和CHOP蛋白水平改變。
　　 結(jié)果顯示，?；撬釡p輕AngⅡ、TG和TM引起的心肌細(xì)胞ANP和BNPmRNA表達(dá)上調(diào)、蛋白質(zhì)合成速率和細(xì)胞表面積的增加。牛磺酸還下調(diào)AngⅡ、TG和TM引起的心肌細(xì)胞ER應(yīng)激分子mRNA和蛋白水平表達(dá)。提示牛磺酸通過(guò)抑制ER應(yīng)激，減輕血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)論如下:ER應(yīng)激是AngⅡ致心肌細(xì)胞肥大的機(jī)制之一。牛