新型乙型肝炎病毒細胞感染模型的建立.pdf

1、研究背景
　　 乙型肝炎病毒感染是全球范圍內(nèi)影響人類健康的重大問題，我國是乙型肝炎高流行地區(qū)，全國一般人群HBsAg陽性率為9.09％，估計約1.2億人為慢性HBV感染，占全世界慢性HBV感染人數(shù)的1/3[1]。目前人們對HBV及其所致疾病有了相當深入的認識，但由于缺乏合適的動物模型及體外細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，乙型肝炎病毒的生物學(xué)研究和治療進展緩慢[2-6]。現(xiàn)有用于研究HBV的細胞模型主要是人原代肝細胞和肝癌細胞系，前者保留了分化肝細

2、胞的重要細胞學(xué)特性，但其缺陷在于在體外培養(yǎng)幾天后開始出現(xiàn)肝細胞特殊形態(tài)的消失，并且失去了對HBV的感染和復(fù)制能力，因而限制了其應(yīng)用；而后者是通過轉(zhuǎn)染HBV基因組或添加化學(xué)試劑而非HBV自然感染的方式進入到細胞中，因此不能用于HBV早期感染過程的研究。為此，本研究旨在通過將經(jīng)化學(xué)誘變劑誘導(dǎo)產(chǎn)生次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)基因突變的HepG2細胞與未攜帶HBV的人原代肝細胞融合建立一新型細胞系，使其能夠自然感染HBV并能體外傳

3、代培養(yǎng)，為HBV感染宿主細胞的早期機制的研究，以及病毒侵入人肝細胞后完整的復(fù)制過程的研究提供一個強有力的工具。
　　 目的
　　 建立一新型細胞株，使該細胞株既能自然感染HBV又能傳代培養(yǎng)，評價雜交細胞對HBV的自然感染能力。
　　 方法：
　　 分離培養(yǎng)未攜帶HBV的人原代肝細胞，與誘導(dǎo)突變的HepG2細胞進行融合得雜交細胞，經(jīng)HAT培養(yǎng)基篩選，利用胰蛋白酶G顯帶技術(shù)鑒定所得細胞，用含HBV的慢性乙型肝

4、炎患者血清感染雜交細胞（同時感染HepG2作為對照），巢式PCR檢測感染后細胞內(nèi)HBVDNA合成及分泌情況及有無HBV復(fù)制中間產(chǎn)物HBVcccDNA，間接免疫熒光檢測感染后細胞內(nèi)HBcAg的表達，電化學(xué)發(fā)光法檢測感染后細胞培養(yǎng)上清中的HBsAg和HBeAg。
　　 結(jié)果：
　　 成功建立人原代肝細胞與HepG2的雜交細胞，能體外傳代培養(yǎng)，染色體核型分析示雜交細胞染色體眾數(shù)為99條，證實為融合細胞，HBV感染后第4天起，雜

5、交細胞內(nèi)和培養(yǎng)上清中均能檢測到HBVDNA，HBV感染后第3天起，雜交細胞內(nèi)可以檢測到HBV的復(fù)制中間產(chǎn)物HBVcccDNA，HBV感染后第4天起，雜交細胞胞漿及部分胞核內(nèi)HBcAg始終是陽性表達，間接免疫熒光染色呈胞漿彌漫性著色，電化學(xué)發(fā)光法檢測培養(yǎng)上清中HBsAg及HBeAg持續(xù)表達；而感染后的HepG2細胞檢測結(jié)果均為陰性。
　　 結(jié)論：
　　 成功建立了一個兼具有人原代肝細胞和HepG2細胞遺傳特性的雜交細胞株，