羊口瘡病毒119蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡分子機(jī)制的研究.pdf

1、羊口瘡病毒(Orf virus，ORFV)，屬痘病毒科副痘病毒屬，是羊傳染性膿皰?。ㄋ追Q羊口瘡）的病原體。ORFV是一種雙鏈DNA病毒，全長(zhǎng)138kb，GC含量64％，有132個(gè)預(yù)測(cè)基因，其中病毒的復(fù)制、形態(tài)和結(jié)構(gòu)主要由中間保守區(qū)域調(diào)節(jié);而兩端則為相對(duì)不保守的基因，這些基因常常與宿主選擇、免疫逃避，免疫調(diào)節(jié)及病毒毒力等相關(guān)。病毒在靶細(xì)胞復(fù)制過程中，會(huì)刺激宿主產(chǎn)生多種細(xì)胞因子和趨化因子，參與免疫調(diào)節(jié)、抗病毒等作用。目前已鑒定了一些ORFV

2、的毒性基因，包括IL-10，CBP，VEGF和干擾素(IFN)抗性基因等，其靶標(biāo)主要為宿主的細(xì)胞因子、趨化因子、NF-κB信號(hào)途徑和凋亡途徑等。這些毒性因子的協(xié)同作用使ORFV具有很強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)作用。
　　ORFV125蛋白是文獻(xiàn)報(bào)道的第一個(gè)ORFV編碼的凋亡相關(guān)蛋白，該蛋白定位于線粒體，能在體外抑制UV誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。也可與Bik，Bim等一系列BH3-only蛋白結(jié)合，中和這些蛋白的促凋亡活性。本課題組前期初步研究發(fā)現(xiàn)ORFV

3、119蛋白定位于線粒體，可抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但其具體的分子調(diào)控機(jī)制尚不清楚。因此，本研究擬對(duì)ORFV119蛋白的功能進(jìn)行深入的研究，明確其調(diào)控宿主細(xì)胞凋亡的作用，并重點(diǎn)研究其發(fā)揮凋亡作用的具體途徑和分子機(jī)制。
　　下面分別對(duì)本課題的研究方法、研究?jī)?nèi)容和研究結(jié)論進(jìn)行總結(jié)。
　　方法:
　　第一章中，主要利用CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、DAPI染色、TUNEL實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)等多種技術(shù)、從不同的角度驗(yàn)證ORFV11

4、9蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡這一作用。第二章中主要采用Caspase激活/抑制實(shí)驗(yàn)和凋亡蛋白芯片技術(shù)初步探討ORFV119誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的途徑，之后通過Western blot和ELISA技術(shù)分析驗(yàn)證ORFV119蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中相關(guān)蛋白和細(xì)胞因子變化情況，進(jìn)而闡明ORFV119蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。
　　內(nèi)容:
　　第一部分:ORFV119誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用的驗(yàn)證
　　在293T細(xì)胞中高表達(dá)ORFV119蛋白，不同時(shí)間

5、點(diǎn)利用CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況;采用兩種不同真核表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染ORFV119蛋白，不同時(shí)間DAPI熒光染色后，激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞核形態(tài)變化。轉(zhuǎn)染119GFP和pEGFP-N1后24h采用TUNEL法檢測(cè)凋亡細(xì)胞DNA斷裂情況。同時(shí)高表達(dá)ORFV119蛋白后24h，AnnexinⅤ-APC和7-AAD雙染，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡細(xì)胞數(shù)。
　　第二部分:ORFV119誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究
　　首先高表達(dá)ORFV119蛋白

6、后24h和48h，利用Caspase激活試劑盒檢測(cè)ORFV119蛋白對(duì)不同Caspase成員的活化程度，初步探討凋亡的分子機(jī)制。為了獲得更多凋亡過程中蛋白或細(xì)胞因子的變化情況，進(jìn)行了人凋亡蛋白芯片檢測(cè)。之后在高表達(dá)ORFV119蛋白的24h和48h，應(yīng)用Western blot和ELISA技術(shù)驗(yàn)證相應(yīng)蛋白及細(xì)胞因子變化水平，進(jìn)一步明確ORFV119誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。
　　結(jié)論:
　　本研究通過DAPI熒光染色，流式細(xì)胞

7、術(shù)，蛋白芯片，Western blot，ELISA等方法研究了羊口瘡病毒ORFV119的分子功能及其對(duì)細(xì)胞凋亡的影響和相關(guān)分子機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，ORFV119蛋白定位于線粒體;能抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用主要為:ORFV119蛋白可使線粒體表面的促凋亡蛋白Bax和Bak上升，線粒體膜通透性增強(qiáng)，釋放細(xì)胞色素C和促凋亡蛋白Smac/Diablo;同時(shí)下調(diào)cIAP-2和Bcl-2兩個(gè)抑制凋亡蛋白，激活Caspase9;釋放

8、的細(xì)胞色素C和活化的Caspase9、Apaf-1因子形成凋亡小體，導(dǎo)致下游Caspase3和PARP的活化使細(xì)胞發(fā)生凋亡。同時(shí)ORFV119蛋白也可激活Caspase8，再直接活化Caspase3使細(xì)胞凋亡，也可使BID活化為tBID通過線粒體途徑發(fā)揮凋亡調(diào)控作用。
　　本研究明確了ORFV119蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用并闡明其分子機(jī)制，使羊口瘡病毒未知基因功能的探索更進(jìn)一步。這些結(jié)果有助于研究羊口瘡病毒的致病機(jī)制和免疫機(jī)理，為疾