環(huán)氧合酶-2抑制劑預防乳腺癌細胞多藥耐藥發(fā)生的研究.pdf

1、目的：1．應用化療藥物阿霉素(doxorubicin，Doxo)誘導乳腺癌細胞株MCF-7獲得性多藥耐藥發(fā)生，以此耐藥誘導模型為基礎將選擇性環(huán)氧合酶-2(COX-2)抑制劑塞來昔布(celecoxib)與耐藥誘導劑量的阿霉素聯(lián)合作用于MCF-7細胞，檢測耐藥相關基因及蛋白的變化，探討塞來昔布對阿霉素誘導MCF-7細胞多藥耐藥發(fā)生的預防作用。2．聯(lián)合應用塞來昔布及阿霉素，探討塞來昔布對阿霉素細胞毒效應的增敏作用。3．從MDR1基因轉錄調控

2、入手，檢測相關轉錄因子在基因、蛋白水平的變化及其與DNA的結合活性，探討塞來昔布下調阿霉素誘導MDR1過表達的機制。 方法：1．四唑藍(MTT)比色法：檢測不同濃度阿霉素對MCF-7細胞的生長抑制效應，尋找適宜的阿霉素濃度及作用時間進行耐藥誘導；聯(lián)合應用阿霉素及低濃度的塞來昔布(無明顯細胞生長抑制效應)，計算阿霉素對MCF-7細胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)，分析塞來昔布對阿霉素細胞毒效應的增敏作用。2．逆轉錄多聚酶鏈反應(RT—

3、PCR)檢測MDR1、MRP1、topoⅡ、GST、NF．KB、c—Jun及YB-1等基因的mRNA表達水平。3．流式細胞術(flowcytometry，F(xiàn)CM)檢測細胞膜P—糖蛋白(P—gp)表達水平。4．細胞內羅丹明123(Rh0123)潴留實驗分析P—gp的功能狀態(tài)。5．免疫印跡反應(Westernblot法)檢測MRP1、NF—κB、c—iun及YB-1蛋白表達水平。6．凝膠遷移滯后實驗(EMSA)方法檢測轉錄因子NF—κB及A

4、P-1與DNA的結合活性。7．FCM檢測阿霉素、塞來昔布單獨作用及聯(lián)合應用對MCF-7細胞周期的影響。 結果：1．MTT結果顯示：阿霉素0.05ug/ml作用于MCF-7細胞，3d后生長受抑制，7d后生長抑制效應明顯減弱，生長抑制率分別為23.70％及9.03％；但在0.5ug/ml的濃度作用下，3d后生長抑制效應明顯，7d后抑制效應進一步增強，生長抑制率分別為60％及72.90％；此表明，阿霉素0.05ug/ml作用7d，可誘

5、導MCF-7細胞耐藥發(fā)生。2．阿霉素0.05ug/ml處理MCF-7細胞7d與末處理組相比：RT—PCR發(fā)現(xiàn)MDR1及MRP1在mRNA水平上調(P＜0.01)；TopoⅡ及GST在mRNA水平差異性不顯著(P＞0.05)；Western—blot發(fā)現(xiàn)MRP1蛋白表達與其mRNA表達水平相一致；FCM顯示細胞膜P—gp表達上調，熒光強度為32.66±2.49，而未處理組為4.67_+0.49(P＜0.01)。3．與阿霉素0.05ug/m

6、l組相比，阿霉素0.05ug/ml聯(lián)合塞來昔布(10uM，20uM)處理7d，MDR1、MRP1在mRNA水平下調(P＜0.01)；其蛋白表達與mRNA表達變化相一致；細胞膜P—gp熒光強度分別為6.41±0.71及5.55±0.50，而阿霉素0.05ug/ml組為32.66±2.49，差異性顯著(P＜0.01)。4．阿霉素0.05ug/ml聯(lián)合塞來昔布(10uM，20uM)處理7d，細胞內Rh123的熒光強度明顯增加，分別為373.0

7、3±15.41及341.44±11.75，與阿霉素單用組72.77±8.88相比，差異性顯著(P＜0.0105．阿霉素0.05ug/ml組與未處理組相比，轉錄因子YB-1、NF—κB和c—Jun在mRNA及蛋白水平均上調；阿霉素0.05ug/ml聯(lián)合塞來昔布10uM組與阿霉素0.05ug/ml組相比，YB-1、NF—κB和c—Jun在mRNA及蛋白水平均下調。6．阿霉素0.05ug/ml組與未處理組相比，轉錄因子NF—κB和AP-1的活

8、性明顯增高；阿霉素0.05ug/ml聯(lián)合塞來昔布10uM組與阿霉素0.05ug/ml組相比，NF—κB和AP-1的活性均明顯降低。7．阿霉素聯(lián)合塞來昔布10uM作用48h后，可顯著抑制MCF-7細胞的生長，IC50為(0.38±0.04)ug/ml，而阿霉素單用的IC50為(0.67±0.03)ug/ml(P＜0.01)。8．與未處理組相比，阿霉素0.05ug/ml組及阿霉素0.05ug/ml聯(lián)合塞來昔布10uM組，G0+G1期細胞比率

9、均增加(P＜0.01)，S期細胞比率均減少(P＜0.01)；塞來昔布10uM單獨作用組G0+G1期及S期細胞比率無顯著差異性(P＜0.05)；與阿霉素0.05ug/ml組相比，阿霉素0.05ug/ml聯(lián)合塞來昔布10uM組G0+G1期細胞比率增加(P＜0.01)，S期細胞比率減少(P＜0.01)；G2+M期細胞比率在各組間均無顯著差異(P＞0.05)。 結論：1．阿霉素0.05ug/ml作用于MCF-7細胞7d可成功誘導多藥耐藥

10、發(fā)生，細胞內MDR1、MRP1在mRNA及蛋白水平均上調。2．在MCF-7細胞中，塞來昔布可有效干預阿霉素誘導的MDR1、MRP1過表達，預防多藥耐藥的發(fā)生。3．塞來昔布下調MDR1基因表達與抑制轉錄因子YB-1、NF—κB和AP-1的表達及活性相關。4．塞來昔布對阿霉素的細胞毒效應有明顯的增敏作用，可將MCF-7細胞阻滯于G0+G1期。 綜上所述，環(huán)氧合酶-2抑制劑塞來昔布可通過多種機制預防乳腺癌細胞多藥耐藥的發(fā)生，為臨床腫瘤