新腫瘤標志物的篩選及功能初步研究.pdf

1、第一章腫瘤標志物的生物信息學篩選及其表達譜初步分析 目的：采用生物信息學方法篩選腫瘤差異表達基因，并對篩選得到的結果進行表達譜初步分析。 方法：利用CGAP網站提供的cDNAx Profiler工具，以人類正常組織和腫瘤組織EST數據庫為基礎，篩選腫瘤差異表達基因，并對篩選得到的68個基因進行染色體定位。采用電子雜交以及RT-PCR的方法對篩選得到的結果進行表達譜初步分析。 結果：通過生物信息學篩選得到在腫瘤組織

2、中特異性表達的基因或EST片段2801個，其中已知基因68個，未知基因2733個。在這68個已知基因中，40個基因的功能已基本明確。在這40個基因中5個基因已經實驗證實為腫瘤特異性基因，占12.5％。對篩選得到的68個基因進行染色體定位，發(fā)現在7號和10號染色體上篩選得到的腫瘤特異性基因較少，而在8號、21號以及X染色體中腫瘤特異性基因出現的頻率明顯多于其他染色體。進一步對篩選得到的2801個腫瘤特異性表達基因或EST片段進行電子雜交分

3、析，9個基因結果較理想。RT-PCR檢測這9個基因在不同細胞株中的表達，7個基因在被檢測的11個細胞株中未得到目的片段，而GABRA3基因與HTA基因在腫瘤細胞中表達特異。 結論：生物信息學篩選腫瘤差異表達基因是一種高效的方法。腫瘤特異性基因在某些染色體上相對“活躍”。 第二章GABRA3基因的表達譜分析及功能研究 目的：對GABRA3基因進行表達譜分析及功能初步研究。檢測GABAA受體各亞單位在腫瘤組織中的表達

4、。 方法：采用RT-PCR以及免疫組化法分析GABRA3的表達譜。通過RNAi以及藥物處理對GABRA3基因的功能進行初步研究。 結果：在被檢測的11株細胞株中，GABRA3基因在肝癌細胞株HepG2，乳腺癌細胞株MCF-7，MDA-MB-231和膠質瘤細胞株U251中表達，而在其他腫瘤細胞株以及正常細胞株中無表達。在被檢測的20種正常組織中，該基因除在腦組織，子宮內膜，胎盤以及前列腺中有表達外，在其他正常組織中均未被檢

5、測到。在18例新鮮肺癌組織標本中GABRA3表達陽性率為66.67％，而對應的18例肺癌癌旁組織中均未檢測到該基因。采用免疫組化的方法，分析GABRA3在60例肺癌及10例癌旁組織中的表達。10例癌旁組織均未染色，而60例肺癌組織標本中GABRA3蛋白表達的陽性率為41.67％，肺癌組織中細胞陽性染色主要見于胞質和胞膜。通過對GABRA3蛋白在肺癌組織中表達量與臨床資料的相關性分析，發(fā)現GABRA3蛋白的表達量肺癌的病理分級密切相關(p

6、<0.05)。隨著腫瘤惡性程度的增高，GABRA3蛋白表達的陽性率和表達量有增高的趨勢。在8例肝癌組織標本中，共6例表達GABRA3基因，陽性率為65％。而在所有對應的癌旁組織中均未擴增得到該基因目的片斷。在肺癌和肝癌組織中，還檢測了GABAA受體其他亞單位的表達情況，除a3亞單位外還有GABAA受體α6、β3、γ2、δ、θ、ε和π亞單位的表達。 在肝癌細胞株HepG2細胞中，檢測到GABA生成過程中的關鍵酶GAD67表達。通過

7、細胞增殖能力研究發(fā)現，GABA對肝癌細胞株HepG2具有促增殖的作用。當GABRA3基因被沉默后HepG2細胞的增殖能力明顯降低。對GABRA3基因被沉默的HepG2細胞給予GABA藥物處理，結果發(fā)現其增殖能力非但沒有增強，反而有減弱的趨勢。 結論：GABRA3基因在肺癌和肝癌中表達上調，其表達量與腫瘤的分化程度密切相關。在肝癌中，肝癌細胞可經GAD67催化產生GABA；GABA發(fā)揮了促腫瘤細胞增殖的作用，其作用是通過上調表達的

8、GABRA3介導的。除GABRA3外，肝癌和肺癌組織中還有GABAA受體其他亞單位的表達，當GABRA3被沉默時，GABA通過這些亞單位發(fā)揮了抑制腫瘤細胞增殖的作用。 第三章HTA基因的表達譜分析及功能研究 目的：對HTA基因進行生物信息學分析，并對該基因進行表達譜分析及功能初步研究。 方法：采用RT-PCR法分析HTA基因的表達譜，通過RNAi對該基因的功能進行初步研究，采用各種在線工具軟件對該基因進行生物信息

9、學分析。 結果：通過RT-PCR檢測到HTA基因在人肝癌細胞株HepG2以及多種腫瘤組織中表達，在肝癌中表達陽性率較高，而在正常肝細胞株L-O以及20種正常組織標本均無表達。采用RNAi技術抑制HTA基因在肝癌HepG2細胞中的表達，通過細胞生長曲線、細胞倍增時間、軟瓊脂集落形成實驗、細胞周期檢測以及裸鼠成瘤實驗研究發(fā)現，HTA基因被沉默后HepG2細胞的增殖能力降低。經生物信息學分析，HTA定位于人類染色體16q22.3，包含