高膽固醇血癥大鼠心肌組織易損性增加的機(jī)制——心肌細(xì)胞膜流動(dòng)性，髓過氧化物酶和部分G蛋白偶聯(lián)受體自身抗體的可能作用.pdf

1、本研究擬在食源性HC大鼠模型的基礎(chǔ)上，探討心肌細(xì)胞膜流動(dòng)性、MPO和部分G蛋白偶聯(lián)受體自身抗體在HC心肌易損性增加中的作用及其部分相關(guān)機(jī)制。 第一部分，高膽固醇血癥誘發(fā)大鼠心肌細(xì)胞膜流動(dòng)性降低。 目的：本部分實(shí)驗(yàn)在食源性HC大鼠模型上，給予吡格列酮(Pioglitazone，PIO)干預(yù)，觀察并分析HC大鼠心肌細(xì)胞膜流動(dòng)性和心肌損傷的變化，探討心肌細(xì)胞膜流動(dòng)性在HC大鼠心肌易損性增加中的作用及其病理機(jī)制。 材料與

2、方法： 1．材料: 健康Wistar遠(yuǎn)交群大鼠，4～5weeks，體重110±10g，雄性。 2．實(shí)驗(yàn)分組: (1)食源性HC大鼠模型分組:①普通飲食大鼠組；②Vehicle+高膽固醇飲食組；③PIO+高膽固醇飲食組。 (2)在體大鼠心臟局部缺血/再灌注后心肌梗塞面積測(cè)定的實(shí)驗(yàn)分組：①偽手術(shù)組;②缺血/再灌注+普通飲食大鼠組;③缺血/再灌注+Vehicle+高膽固醇飲食組；④缺血/再灌注+PIO

3、+高膽固醇飲食組。 3．方法: (1)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕⒓皹?biāo)本的留取:①食源性HC大鼠模型的建立及標(biāo)本留取：②大鼠在體頸總動(dòng)脈插管及標(biāo)本留?。虎蹎蝹€(gè)心肌細(xì)胞的分離及標(biāo)本留?。虎艽笫笤隗w心臟局部缺血/再灌注模型的建立及標(biāo)本留取。 (2)檢測(cè)指標(biāo)的測(cè)定：①大鼠空腹血清總膽固醇(Total Cholesterol，TC)、甘油三酯(Triglyceride，TG)和低密度脂蛋白—膽固醇(Low Density Lipopr

4、otein Cholesterol，LDL—cho)的測(cè)定；②心功能測(cè)定；③心肌細(xì)胞膜Na+—K+—ATPase活性的測(cè)定；④心肌細(xì)胞膜膽固醇含量、磷脂含量和膽固醇/磷脂比值(C/P)的測(cè)定；⑤心肌細(xì)胞膜流動(dòng)性的測(cè)定；⑥心肌組織cAMP含量的測(cè)定；⑦大鼠心肌梗塞面積的測(cè)定；⑧心肌細(xì)胞膜流動(dòng)性與心功能和缺血/再灌注后心肌梗塞面積的相關(guān)性分析。 小結(jié): 1．HC引起大鼠心功能下降，缺血/再灌注后心梗面積明顯增大，提示在HC時(shí)

5、心肌損傷易感性增加； 2．HC導(dǎo)致心肌細(xì)胞膜Na+—K+—ATPase活性降低，膜流動(dòng)性下降，膜C/P比值升高，心肌細(xì)胞cAMP含量降低，而且膜流動(dòng)性與心功能和心梗面積具有相關(guān)性，提示HC可能通過膜流動(dòng)性降低，進(jìn)而心肌細(xì)胞跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能受阻，最終導(dǎo)致HC情況下心功能受神經(jīng)體液調(diào)控能大下降而惡化心肌損仿； 3．PIO干預(yù)顯著抑制HC誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞膜C/P升高和膜流動(dòng)性的下降以及膜Na+—K+—ATPase活性降低，以及細(xì)

6、胞cAMP含量的減少，恢復(fù)心功能和減小缺血/再灌注后心梗面積。進(jìn)一步提示HC大鼠心肌細(xì)胞膜流動(dòng)性改變可能是HC大鼠心肌易損性增加的原因之一。 第二部分, 髓過氧化物酶對(duì)高膽固醇血癥大鼠缺血/再灌注心肌易損性增加的作用。 目的：本部分實(shí)驗(yàn)通過觀察HC大鼠缺血/再灌注心肌組織MPO分布和活性的變化，以及這一變化與HC大鼠MUR損傷之間的關(guān)系，說明MPO在HC大鼠缺血/再灌注心肌易損性增加中所發(fā)揮的作用并探討其所涉及的部分損傷

7、機(jī)制(如：NO有效利用率的下降等)。 材料和方法： 1．材料： (1)健康Wistar遠(yuǎn)交群大鼠，4～5weeks體重110±10g，雄性；(2)H9c2(2-1)細(xì)胞株。 2．實(shí)驗(yàn)分組： (1)食源性HC大鼠模型分組：①普通飲食大鼠組；②Vehicle+高膽固醇飲食組；③ABAH+高膽固醇飲食組。 (2)在體大鼠心臟局部缺血/再灌注后心肌梗塞面積測(cè)定的實(shí)驗(yàn)分組: ①偽手術(shù)組；②缺血/再灌

8、注+普通飲食大鼠組；③缺血/再灌注+Vehicle+高膽固醇飲食組；④缺血/再灌注+ABAH+高膽固醇飲食組。 (3)H9c2(2-1)細(xì)胞株實(shí)驗(yàn)分組：①常氧組(Control)；②ABAH+常氧組；③缺氧/復(fù)氧組(H/R)；④MPO+缺氧/復(fù)氧組；⑤ABAH+缺氧/復(fù)氧組；⑥ABAH+MPO+缺氧/復(fù)氧組。 3．方法： (1)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕⒓皹?biāo)本的留?。孩偈吃葱訦C大鼠模型的建立及標(biāo)本的留??；②大鼠在體心臟局部

9、缺血/再灌注模型的建立及標(biāo)本的留??；③H9c2(2-1)細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型的建立及標(biāo)本的留取。 (2)檢測(cè)指標(biāo)的測(cè)定：①大鼠空腹血清總膽固醇(Total Cholesterol，TC)、甘油三酯(Triglyceride，TG)和低密度脂蛋白—膽固醇(Low Density Lipoprotein Cholesterol，LDL—cho)的測(cè)定；②血清和培養(yǎng)液上清肌酸激酶(Creatine Kinase，CK)含量的測(cè)定；③血清

10、和培養(yǎng)液上清乳酸脫氫酶(Lactate Dehydrogenase，LDH)含量的測(cè)定；④DNA原位末端缺口標(biāo)記法(TUNEL)檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡；⑤心肌細(xì)胞caspase-3相對(duì)活性檢測(cè)；⑥大鼠缺血/再灌注后心肌梗塞面積的測(cè)定；⑦大鼠心功能監(jiān)測(cè)；⑧免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)心肌組織MPO分布；⑨心肌組織MPO活性檢測(cè)；⑩心肌組織MPO活性與血清CK含量、LDH含量、凋亡指數(shù)、caspase-3活性、心肌梗塞面積和心功能的相關(guān)性分析；()心肌組

11、織一氧化氮(nitric oxide，NO)含量測(cè)定：()放射性免疫試劑盒測(cè)定心肌組織cGMP含量；()Western—blot檢測(cè)心肌組織一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)的蛋白表達(dá)；()實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)心肌組織NOS的mRNA表達(dá)；(15)細(xì)胞計(jì)數(shù)Kit-8檢測(cè)H9c2(2-1)細(xì)胞增殖。 小結(jié)： 1．HC大鼠心肌組織MPO含量和活性明顯升高，提示MPO活性的改變可能是HC使缺血/

12、再灌注后心肌損傷惡化的原因之一； 2．HC大鼠缺血/再灌注后心肌組織MPO含量和活性顯著升高的同時(shí)NO/cGMP通路受損，NO生物利用率下降，進(jìn)一步提示我們HC缺血/再灌注后心肌損傷易感性增加可能部分是通過MPO活性的改變影響NO—cGMP信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)。 第三部分，高膽固醇血癥誘導(dǎo)大鼠血清α1—、β1—腎上腺素受體和M2-膽堿受體自身抗體的產(chǎn)生。 目的：本部分實(shí)驗(yàn)首先選擇α1—AA、β1—AA、β3—AA、M2

13、-AA和AT1—AA陰性的健康雄性大鼠建立食源性HC大鼠模型：進(jìn)而觀察食源性HC是否會(huì)誘發(fā)G蛋白偶聯(lián)受體自身抗體的產(chǎn)生；如果會(huì)，則進(jìn)一步了解自身抗體的產(chǎn)生情況及其作用。 材料和方法： 1．材料：健康Wistar遠(yuǎn)交群大鼠，4～5weeks體重110±10g，雄性。 2．實(shí)驗(yàn)分組：食源性HC大鼠模型分組：①普通飲食大鼠組；②高膽固醇飲食6周組；③高膽固醇飲食10周組。 3．方法： (1)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕?/p>

14、立及標(biāo)本的留取。 食源性HC大鼠模型的建立及標(biāo)本的留取。 (2)檢測(cè)指標(biāo)的測(cè)定：①大鼠空腹血清總膽固醇(Total Cholesterol，TC)、甘油三酯(Triglyceride，TG)和低密度脂蛋白-膽固醇(Low Density Lipoprotein Cholesterol，LDL—cho)的測(cè)定；②心肌組織石蠟切片的HE染色；③心肌組織超微結(jié)構(gòu)電鏡觀察；④血清受體自身抗體(α1—AA、β1—AA、β3—AA、

15、M2-AA和AT1—AA)的測(cè)定；⑤流式細(xì)胞儀檢測(cè)大鼠脾臟淋巴細(xì)胞CD4+/CD8+和淋巴細(xì)胞含量。 (3)肽段合成及自身抗體的測(cè)定： 5種抗原肽段由吉爾生化上海有限公司合成，分別相當(dāng)于α1—AR、β1—AR、β3—AR、M2-AR和AT1—AR細(xì)胞外第二環(huán)氨基酸序列的特異性抗原決定簇，合成肽段純度為90％～95％。用ELISA法檢測(cè)血清中各自身抗體的含量。 小結(jié)： 1．本研究首次在HC大鼠血清中發(fā)現(xiàn)了α

16、1—AA、β1—AA和M2-AA等G蛋白偶聯(lián)受體自身抗體。 2．HC大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)和脾臟免疫系統(tǒng)功能發(fā)生改變，提示HC有可能通過引起心肌重構(gòu)并激活機(jī)體免疫系統(tǒng)，從而誘發(fā)部分G蛋白偶聯(lián)受體自身抗體產(chǎn)生，并進(jìn)一步影響HC大鼠心臟功能。 結(jié)論： 1．HC可以誘發(fā)心肌細(xì)胞膜脂質(zhì)比例失調(diào)，降低心肌細(xì)胞膜流動(dòng)性，引起心肌細(xì)胞功能障礙，從而導(dǎo)致心肌損傷加重；有效的改善心肌細(xì)胞膜流動(dòng)性可以減輕心肌細(xì)胞損傷。提示心肌細(xì)胞膜流動(dòng)性