脈沖電磁場促進骨髓間充質(zhì)干細胞增殖和成骨分化的實驗研究.pdf

1、目的：(1)體外培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)；(2)研究脈沖電磁場對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞增殖的影響；(3)研究脈沖電磁場對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化的影響；(4)MAPK-ERK、P38信號通路在脈沖電磁場促進大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞增殖和成骨分化中作用的研究。
　　 方法：用密度梯度離心+貼壁篩選法體外分離培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells

2、，MSCs)，用于實驗的細胞均為第4代細胞。
　　 (1)體外培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞，并對細胞純度進行鑒定。
　　 (2)研究脈沖電磁場對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞增殖的影響，增殖實驗共進行了三次，每次用于增殖實驗的MSCs分為5組，一個對照組和四個磁刺激處理組。將培養(yǎng)板置于Helmholtz線圈中心利用50Hz脈沖電磁場進行磁場照射，磁場方向與培養(yǎng)板各孔底平行，每次照射30min，每天兩次，中間間隔11.5h，持續(xù)3d。在

3、完成脈沖電磁場照射處理后，采用四唑鹽比色法(MTT法)測取細胞增殖水平。最后在酶標儀上以490nm波長測取每孔的吸光度值(OD490)。
　　 (3)脈沖電磁場對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化的影響，采用細胞爬片的方法。對于磁刺激組，磁場照射時，采用50Hz脈沖電磁場，磁場方向與培養(yǎng)板各孔底平行，磁場幅值設為0.8 mT，每次照射30min，每天兩次，中間間隔11.5h，持續(xù)5d。ALP染色檢測脈沖電磁場對骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化

4、的影響。
　　 結果：(1)體外培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞，并對細胞純度進行鑒定，表明本實驗所采用的方法獲得的骨髓間充質(zhì)干細胞的純度較高。
　　 (2)增殖實驗的結果可以看出：a)變化趨勢基本相同，說明具有一定的重復性；b)增殖率與所接受刺激的磁場幅值具有非線性關系，說明存在窗口效應；c)第二次實驗結果與第一次實驗結果相比，磁刺激效果降低。其主要原因是細胞的增殖具有飽和效應，即細胞在一定面積的培養(yǎng)容器內(nèi)增殖到一定程度后，增

5、殖速度將自動減慢；d)通過實驗得出磁感應強度有效值在0.8 mT附近，磁效應較顯著，經(jīng)過細化幅值窗口，并通過實驗，進一步得出：MSCs細胞(接種密度為4000個/孔)在特定刺激模式(50Hz脈沖電磁場，每天刺激2次，每次30min，中間間隔11.5小時，持續(xù)3d)下，0.8 mT磁刺激組效果最顯著。
　　 (3)50Hz、0.8 mT脈沖電磁場照射(30min/次、2次/d、間隔11.5h、持續(xù)5d)能明顯促進大鼠骨髓間充質(zhì)干細

6、胞(MSCs)體外成骨分化。
　　 (4)ERK通路在脈沖電磁場促進骨髓間充質(zhì)干細胞增殖中起重要作用，而P38通路的作用相對較弱；P38通路脈沖電磁場促進骨髓間充質(zhì)干細胞促成骨分化過程中起重要作用，而ERK通路則相對較弱。
　　 結論：(1)本實驗所采用的方法體外培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞，骨髓間充質(zhì)干細胞的純度較高。(2)脈沖電磁場促進大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞增殖具有一定的重復性。(3)脈沖電磁場促進大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞增殖

7、存在窗口效應。(4)脈沖電磁場促進大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞增殖具有飽和效應。(5)MSCs細胞在50Hz脈沖電磁場，每天刺激2次，每次30min，中間間隔11.5h，持續(xù)3d作用下，0.8 mT磁刺激組效果最顯著。(6)50Hz、0.8 mT脈沖電磁場照射(30min/次、2次/d、間隔11.5h、持續(xù)5d)能明顯促進大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)體外成骨分化。(7)ERK通路在脈沖電磁場促進骨髓間充質(zhì)干細胞增殖中起重要作用，而P38通路