部分落葉松屬植物重復序列及分子核型的研究.pdf

1、落葉松屬(Larix)是松科(Pinaceae)中較進化且分布廣泛的一個屬，對該屬進行基因組組成和結(jié)構(gòu)分析，對于研究松科乃至整個裸子植物類群的基因組進化和物種系統(tǒng)發(fā)育具有重要的意義。迄今為止，對落葉松屬的細胞學研究仍停留在早期的常規(guī)核型分析和簡單的染色體熒光分帶水平，分子細胞遺傳學方向的研究相對貧乏。本文以多種不同的基因組重復序列為切入點，對落葉松屬的興安落葉松(Larix gmelinii)、華北落葉松(L. principis-ru

2、pprechtii)、日本落葉松(L．kaempferi)和長白落葉松(L .olgensis)的基因組組構(gòu)特點及精細核型結(jié)構(gòu)進行了研究。包括45S和5S核糖體RNA基因及落葉松屬染色體DAPI帶紋區(qū)域特異序列LPD串聯(lián)重復序列的染色體物理定位，端粒序列和高拷貝DNA重復序列的分離和鑒定，以及最后將以上各種重復序列作為探針，應用多色熒光原位雜交技術(shù)，對這4種落葉松體細胞中期染色體進行了綜合熒光標記，構(gòu)建了落葉松屬植物的分子核型。具體研究

3、結(jié)果歸納為以下三個部分： 1．應用不對稱PCR分析的方法，以包含5個重復單元的擬南芥型端粒重復序列(TITAGGG)5和(CCCTAAA)<,5>分別為單引物，從興安落葉松基因組中進行擴增，分離并克隆了若干單一片段，對其中的4個克隆LTA14、LTB2、LTB15和LTB28進行了多方面的鑒定。核酸分子組成和Southem雜交分析表明，這4個克隆均含有一定比例的擬南芥型端粒重復序列和其簡并序列，并廣泛存在于整個落葉松基因組中；核

4、酸序列中AT含量為58.8％～63.4％。FISH定位分析顯示，LTA14和LTB2在整個基因組中具有較弱的彌散信號，在所有染色體端部呈現(xiàn)雙點狀信號，在染色體臂間部具特異性條帶信號；LTB15均勻地彌散存在于整個基因組；LTB28僅在染色體末端具較弱的雙點狀信號。以上結(jié)果說明落葉松屬的染色體端粒部位的DNA序列很可能仍主要由擬南芥型TRS組成，但含量較低，可能在進化過程中，大部分重復單元發(fā)生了變異或退化。 2．發(fā)展了PCR分析與

5、分子雜交分析相結(jié)合分離高拷貝重復序列的策略，從日本落葉松基因組中，首先以十堿基寡核苷酸引物進行隨機PCR擴增，得到206條不同的擴增片段；應用相繼進行的斑點雜交、Southern雜交和克隆策略對這些片段進行篩選，最終得到6個含有高拷貝重復序列的克隆LRA82.1、LRA82.2、LRA98、LRA129、LRA241.3和LRA427。將這6個克隆在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行比對，未發(fā)現(xiàn)同源序列，但其中的LRA82．1、LRA82．2、

6、LRA98間存在300bp～400 bp的同源區(qū)段。SolJthern雜交分析顯示，6個LRA克隆均為彌散型重復序列片段，并保守地存在于落葉松屬各個種中，但不同種間的拷貝數(shù)略有差異。FISH定位結(jié)果顯示，6個克隆均存在彌散分布信號，其中LRA241-3均勻分布于整個基因組；LRA82．1、LRA82.2、LRA98在染色體組中的若干區(qū)域存在缺失，這些區(qū)域為SC和部分染色體著絲粒；LRA129和LRA427則在染色體特定區(qū)域存在擴增而呈現(xiàn)

7、出較強的條帶模式信號。 3．常規(guī)核型分析顯示，落葉松屬不同種之間具有保守的二型核型，包括一組由12條中部著絲粒染色體組成的長染色體群和一組由12條近中部著絲?；蚪瞬恐z粒染色體組成的中長染色體群，核型公式可以統(tǒng)一為2n=2x=12m+ 10sm+2sm (2st)。以25S和5S rDNA、LPD序列、端粒序列克隆LTA14和彌散型重復序列克隆LRA427等5種探針，分組混合后，分兩次與相同的細胞進行多色熒光原位雜交。各種探針

8、在不同染色體上產(chǎn)生了不同排列組合的標記模式，使幾乎全部的染色體可以被區(qū)分。在此過程中，本研究首次將組和標記探針方法應用于植物分子核型構(gòu)建和裸子植物的分子細胞遺傳學研究。以興安落葉松為參照，設定了統(tǒng)一的落葉松屬分子核型標準模式，將不同落葉松的染色體分為12組，同組內(nèi)染色體視為同源或部分同源染色體。在這個標準中，我們可以最終確定以上各種重復序列在落葉松中的染色體定位，其中，45S rDNA位點分別位于3號、4號和8號(日本落葉松除外)染色體

9、的SC，5S rDNA位于3號染色體短臂近端部區(qū)域；4個種的10號染色體不具LPD序列位點，而興安落葉松和華北落葉松中的11號染色體則具不穩(wěn)定LPD序列位點；LRA427克隆則分別在1號、7號、8號(日本落葉松特有)、10號、11號(興安落葉松和華北落葉松)和12號染色體上具有特異擴增條帶信號。 本研究進一步將以上研究結(jié)果與其它松科植物進行了比較，對落葉松屬基因組組構(gòu)及系統(tǒng)位置進行了初步探索；應用構(gòu)建的分子核型，進行了種間核型比