農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將草酸氧化酶基因?qū)霟煵莺碗p低油菜的研究.pdf

1、油菜菌核病(Sclerotinia.sclerotiorum)是一種世界范圍的真菌性病害。在中國(guó)，油菜菌核病居油菜三大病害之首，嚴(yán)重影響了我國(guó)的油菜生產(chǎn)。近年來(lái)，隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展以及油菜轉(zhuǎn)化體系的建立，許多學(xué)者通過(guò)基因工程的手段研究油菜的抗病性。核盤菌能侵染400多種植物。根據(jù)它致病的關(guān)鍵因子去尋求控制策略是最根本的途徑。由于它產(chǎn)生高度致病因子一草酸，因此引入編碼草酸降解酶的基因來(lái)獲得對(duì)分泌草酸病原真菌的抗性是一個(gè)極具前途的方法。

2、為研究草酸氧化酶基因(Oxalate oxidase gene，OxO)對(duì)植物抗病的作用及獲得抗菌核病油菜植株，本研究以煙草(Nicotiana tabacum)和雙低甘藍(lán)型油菜(Double-low.Brassica napus)為試材，將來(lái)自于小麥的草酸氧化酶基因進(jìn)行了農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化，主要工作及結(jié)果如下： 1.適宜農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系的建立 以煙草常規(guī)品種和甘藍(lán)型雙低油菜品種為材料，選用煙草葉片，油菜子葉柄作為轉(zhuǎn)化受體，建

3、立了適宜的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系。 通過(guò)對(duì)各種影響因素的分析，最終確定煙草轉(zhuǎn)化再生系統(tǒng)中最適培養(yǎng)基為：I.分化培養(yǎng)基：MS+4 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA，pH 5.8．Ⅱ.篩選培養(yǎng)基：分化培養(yǎng)基+100 mg/Km(卡那霉素)+500 mg/LCb(羧芐青霉素)，pH 5.8。Ⅲ.生根培養(yǎng)基：1/2 MS+2 mg/L IBA+100 mg/LKm+300 mg/L C b(羧芐青霉素)，pH 5.8 油菜轉(zhuǎn)

4、化再生系統(tǒng)中最適培養(yǎng)基為：I. 預(yù)培養(yǎng)基：MS+1 mg/L2,4.D+0.2 mg/L 6-BAII.分化培養(yǎng)基：MS+2.5mg/L 6-BA+0.1 mg/LNAA'pH 5.8。Ⅱ.篩選培養(yǎng)基：分化培養(yǎng)基+10.15 mg/LKm+500 mg/LCb+6 mg/LAgNO<,3>，pH 5.8。Ⅲ.生根培養(yǎng)基：1/2：MS+2 mg/LIBA+20 mg/LKm+300 mg/LCb，pH 5.8。 2.卡那霉素抗性苗

5、的獲得 首先用處于對(duì)數(shù)分裂中期OD<,600>為0.3～0.4左右時(shí)的帶有草酸氧化酶基因的農(nóng)桿菌菌液侵染材料，再通過(guò)與農(nóng)桿菌的共培養(yǎng)，最后用卡那霉素篩選，得到煙草卡那霉素抗性苗11株，油菜卡那霉素抗性苗12株。 3．抗性苗的PCR檢測(cè) 利用特異引物對(duì)抗性苗進(jìn)行PCR檢測(cè)，11株煙草卡那霉素抗性苗中的9株，12株油菜卡那霉素抗性苗中的7株表現(xiàn)陽(yáng)性，擴(kuò)增出與陽(yáng)性對(duì)照一致的470 bp草酸氧化酶基因片段。 4．