淫羊藿苷促進兔顱骨缺損修復(fù)愈合的影響和機制的探討.pdf

1、目的:
　　 由于感染，外傷，腫瘤，先后天畸形，內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病造成的骨缺損，畸形，功能障礙，給患者的生活質(zhì)量帶來很大的影響，尤其是對于口腔頜面部。因此尋找一種簡便、快捷、有效的方法促進骨創(chuàng)的修復(fù)，成為外科領(lǐng)域研究的熱點和難點。
　　 目前對如何促進骨愈合的研究很多。一些高分子生物材料植入，人工替代物植入，自體骨移植，組織工程化骨移植，低強度脈沖電磁場治療等均有一定療效，由于都存在或多或少的缺點，未能在臨床上廣泛應(yīng)用。

2、r>　　 多年以來，國內(nèi)外學者借助組織學、組織化學，組織形態(tài)計量學，生物力學等手段對骨創(chuàng)愈合進行了大量的實驗觀察，對骨創(chuàng)愈合機制也進行了廣泛的探討。近年來，由于基因技術(shù)的發(fā)展應(yīng)用，人們對骨創(chuàng)愈合的認識已從細胞生物學向分子生物學水平深化，并隨著分子生物學的不斷發(fā)展，已經(jīng)認識到骨創(chuàng)愈合與多種生長因子有關(guān)，除內(nèi)分泌、代謝因子等全身因子外，骨創(chuàng)局部尚有大量的生長因子，對骨創(chuàng)愈合起著重要的調(diào)節(jié)作用，如:TGF-β(轉(zhuǎn)化生長因子)，VEGF(血管

3、內(nèi)皮細胞生長因子)，F(xiàn)GF(成纖維細胞生長因子)，BMP(骨形態(tài)發(fā)生蛋白)，神經(jīng)生長因子(nervegrowthfactor，NGF)等。
　　 中藥對加速骨折愈合機理的實驗研究始自上世紀60年代，大致有如下幾個方面的成果:中藥改善骨折部的血液供應(yīng)，促進血腫的吸收與機化;促進礦物質(zhì)的沉積;增加成骨細胞的數(shù)量和活性，提高微量元素等。淫羊藿(Herbaepimedii)是一種傳統(tǒng)的補益中藥，臨床上用來治療骨折及與骨代謝有關(guān)的許多疾病

4、，并取得了良好的效果。研究結(jié)果表明，淫羊藿具有增強機體免疫功能，抗腫瘤，影響內(nèi)分泌加強性腺功能、延緩衰老和影響心血管系統(tǒng)等多種重要的藥理活性。淫羊藿的有效活性成分淫羊藿苷(icariin，C33H40O15，分子量:676.67)，屬黃酮類化合物。李芳芳等將淫羊藿苷與大鼠卵泡顆粒細胞和腎上腺皮質(zhì)細胞共同培養(yǎng)，顯示一定濃度的淫羊藿苷可促使卵泡顆粒細胞分泌雌二醇，高濃度時還可促進腎上腺皮質(zhì)細胞分泌皮質(zhì)類固醇，提示淫羊藿補腎壯陽功效:作用下丘

5、腦垂體-性腺軸及腎上腺軸，可有效調(diào)節(jié)體內(nèi)激素的水平，改善骨代謝，促進蛋白質(zhì)合成。由于淫羊藿苷在骨創(chuàng)愈合，修復(fù)中起到積極的作用，淫羊藿在促進骨愈合方面的研究成為研究熱點，淫羊藿提取物:淫羊藿苷對成骨細胞增殖代謝的影響，體外實驗董福生課題組已經(jīng)完成。
　　 本研究通過制作新西蘭大白兔顱骨模型，術(shù)后采用淫羊藿苷灌胃，應(yīng)用組織學和骨計量學方法，觀察在骨缺損不同的愈合階段，顱骨缺損區(qū)新生骨量，骨愈合速度和成骨質(zhì)量。
　　 同時提取

6、顱骨缺損修復(fù)區(qū)新生骨組織mRNA，采用RT-PCR(realtime-polymerasechainreaction)方法，檢測成骨細胞促進骨生成的基因變化情況，進一步研究在新骨形成的過程中和應(yīng)用淫羊藿苷治療后，相關(guān)基因的變化，相互聯(lián)系，尋找成骨的分子信號傳導(dǎo)通路。
　　 在以上研究的基礎(chǔ)上，通免疫組化方法，觀察新骨形成區(qū)骨鈣素和骨橋素的表達，初步探討淫羊藿苷促進骨形成的機制。為淫羊藿苷在促進骨愈合的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)，奠定基

7、礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 1、淫羊藿苷對兔顱骨缺損修復(fù)愈合質(zhì)量的影響
　　 選用2月齡雌性新西蘭大白兔，隨機分為用藥組和對照組，制作顱骨缺損動物模型，用藥組術(shù)后給予淫羊藿苷灌胃，分別于術(shù)后4周、8周、12周處死動物，留取標本，拍射X線片觀察;制作組織切片，HE染色，觀察顱骨缺損區(qū)愈合情況;骨計量學觀察新骨形成區(qū)骨小梁平均寬度(TraberculaeWidth，Tb·Wiμm)，骨小梁面積比(Trabercular

8、AreaTb.Ar％)，成骨細胞個數(shù)(OsteoblastNumber,OB·N)，破骨細胞個數(shù)(OsteoclastNumber,OC·N)，觀察新骨形成區(qū)骨量的變化，研究淫羊藿苷對兔顱骨缺損愈合的影響。
　　 2、淫羊藿苷促進兔顱骨缺損修復(fù)RANKL基因、RUNX2基因表達的影響
　　 選用2月齡雌性新西蘭大白兔，動物分組，動物模型制作，動物給藥方法和劑量同第一部分，分別于術(shù)后4周、8周、12周留取標本后，提取顱骨缺

9、損修復(fù)區(qū)新生骨組織mRNA，采用RT-PCR(realtime-polymerasechainreaction)方法，檢測成骨細胞促進骨生成的基因變化情況，本部分實驗所研究差異表達基因的重點:是關(guān)于成骨細胞增殖分化調(diào)節(jié)、成骨細胞功能調(diào)節(jié)和骨代謝調(diào)節(jié)等方面。
　　 3、淫羊藿苷促進兔顱骨缺損修復(fù)區(qū)成骨相關(guān)蛋白骨鈣素、骨橋素的表達
　　 選用2月齡雌性新西蘭大白兔，動物分組，動物模型制作，動物給藥方法和劑量同第一部分，分別于

10、術(shù)后4周、8周、12周留取標本后，通過免疫組化方法，觀察新骨形成區(qū)成骨細胞骨基質(zhì)蛋白的表達情況:骨鈣蛋白和骨橋蛋白的表達。
　　 結(jié)果:
　　 1、淫羊藿苷對兔顱骨缺損修復(fù)愈合質(zhì)量的影響
　　 1.1、一般觀察
　　 術(shù)后4周，對照組骨缺損區(qū)微凹陷，為纖維組織覆蓋，邊界清晰可辯，周邊未見明顯新骨形成。實驗組顱骨缺損區(qū)中央局部凹陷，邊界模糊不清，周圍可見少量薄、半透明新骨生長。
　　 術(shù)后8周，對照

11、組骨缺損區(qū)表面及周邊部骨痂形成，中央部略凹陷，較邊緣為薄。實驗組骨缺損區(qū)被均勻的硬組織覆蓋，與周邊骨質(zhì)有明顯骨融合。
　　 術(shù)后12周，對照組骨缺損區(qū)表面及周邊部骨痂形成，形態(tài)基本接近正常顱骨外形。實驗組骨缺損區(qū)可見新形成的骨組織覆蓋，與邊緣無明顯界限。
　　 1.2、X線觀察
　　 術(shù)后4周，對照組骨缺損處為低密度影，骨缺損邊清晰。實驗組缺損處為低密度影，骨缺損邊緣模糊。
　　 術(shù)后8周，對照組骨缺損區(qū)

12、域密度低于缺損周圍骨質(zhì)，與正常組織間界限明顯。實驗組骨缺損區(qū)域內(nèi)密度略高于對照組，界限模糊，缺損范圍明顯縮小。
　　 術(shù)后12周，對照骨組缺損區(qū)域呈骨性低密度區(qū)，與正常組織間界限明顯。實驗組缺損區(qū)域與周圍骨質(zhì)無明顯界限，密度基本一致。
　　 1.3、組織學觀察
　　 術(shù)后4周，對照組可見缺損邊緣有少量類骨質(zhì)和新骨形成，中央為纖維組織，大量的炎性細胞廣泛浸潤。實驗組缺損區(qū)中央為纖維結(jié)締組織充填，可見粗大的膠原纖維，

13、中間散在少量炎性細胞，部分區(qū)域出現(xiàn)纖維骨樣結(jié)構(gòu)，大量新生骨質(zhì)，成骨細胞較多成柵欄狀排列在骨小梁周圍。
　　 術(shù)后8周，對照組缺損區(qū)存在大量結(jié)構(gòu)疏松的纖維結(jié)締組織，且炎癥細胞仍廣泛存在，缺損區(qū)邊界有部分骨樣和纖維骨樣組織生成，其內(nèi)有一定量的成骨細胞存在。實驗組缺損區(qū)內(nèi)有大量骨質(zhì)形成，骨小梁連續(xù)，增厚，形成板層結(jié)構(gòu)，部分成網(wǎng)織狀，為較成熟骨，部分區(qū)域內(nèi)骨質(zhì)致密，形成板層狀骨，中央為骨髓腔。
　　 術(shù)后12周，對照組新生骨向中

14、央逐漸充填骨缺損，缺損內(nèi)可見較多新生的編織骨及板層骨。骨小梁連續(xù)，細胞成分較少，纖維成分較實驗組多。實驗組骨缺損處為成熟骨質(zhì)，骨細胞豐富，骨小梁粗大，排列整齊，較明顯的骨髓腔出現(xiàn)并連續(xù)。
　　 1.4、骨計量學觀察
　　 術(shù)后4周，用藥組與對照組比較:用藥組的松質(zhì)區(qū)骨量(Tb·Ar％)，骨小梁寬度(Tb·Wiμm)，成骨細胞個數(shù)(OB·N)均明顯大于對照組(P＜0.01);破骨細胞個數(shù)(CB·N)明顯低于對照組(P＜0.

15、01)。術(shù)后8周，用藥組與對照組比較:用藥組的松質(zhì)區(qū)骨量（Tb·Ar％），骨小梁寬度(Tb·Wiμm)，成骨細胞個數(shù)(OB·N)均明顯大于對照。組(P＜0.01);破骨細胞個數(shù)(CB·N)明顯低于對照組(P＜0.01)。術(shù)后12周，用藥組與對照組比較:用藥組的松質(zhì)區(qū)骨量（Tb·Ar％），骨小梁寬度(Tb·Wiμm)，成骨細胞個數(shù)(OB·N)均明顯大于對照組(P＜0.01);破骨細胞個數(shù)(CB·N)兩組之間無顯著性差異(P＞0.05)。<

16、br>　　 2、淫羊藿苷促進兔顱骨缺損修復(fù)RANKL基因、RUNX2基因表達的影響
　　 2.1、mRNA純度及完整性鑒定
　　 分光光度法測定結(jié)果顯示:對照組及用藥組總RNA的OD260/OD280比值在1.8～2.0之間，純度及濃度符合實驗要求。
　　 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示:對照組及用藥組總RNA經(jīng)變性凝膠電泳后可見明顯的28S及18S條帶出現(xiàn)，28S條帶亮度約為18S條帶的兩倍，各組提取的RNA完整性良

17、好，符合實驗要求。
　　 2.2、Real-timePCR定量分析結(jié)果
　　 在術(shù)后4周，8周，12周時用藥組和對照組Rank1、Runx2基因的mRNA表達結(jié)果:在術(shù)后4周，8周，12周時Rank1基因表達水平用藥組均明顯低于對照組，Runx2基因的表達水平用藥組均明顯高于對照組。
　　 3、淫羊藿苷促進兔顱骨缺損修區(qū)成骨相關(guān)蛋白骨鈣素，骨橋素的表達
　　 3.1、骨鈣素OC在新骨形成區(qū)的表達
　

18、　 用藥后4周，實驗組骨鈣素OC的表達呈強陽性;對照組，OC在成骨細胞的胞漿和骨基質(zhì)中陰性表達。8周時實驗組OC的表達呈強陽性，對照組呈弱陽性表達。12時周實驗組OC的表達呈強陽性，對照組呈弱陽性表達。
　　 3.2、骨橋素OPN在新骨形成區(qū)的表達
　　 用藥后4周實驗組骨橋素OPN在成骨細胞的胞漿中呈強陽性表達，在骨基質(zhì)中呈強陽性表達，對照組呈陰性表達。8周時實驗組OPN的表達為強陽性;對照組呈弱陽性表達。12周時實

19、驗組OPN在呈強陽性表達;對照組呈弱陽性表達。
　　 結(jié)論:
　　 1、淫羊藿苷能夠增加兔顱骨缺損區(qū)成骨骨量，提高愈合質(zhì)量。
　　 2、淫羊藿苷能夠促進兔顱骨缺損愈合，加快顱骨缺損的愈合速度。
　　 3、淫羊藿苷在成骨過程中，發(fā)揮雌激素樣作用，通過下調(diào)Rank1基因，減少破骨細胞的活化，抑制破骨細胞的功能，增加成骨。
　　 4、淫羊藿苷能上調(diào)成骨基因Runx2，通過經(jīng)典Wnt/β-catenin途