天花粉蛋白抗腫瘤作用的分子機(jī)理研究.pdf

1、天花粉蛋白(trichosanthin，TCS)是從葫蘆科植物栝樓(TrichosantheskirilowiiMaxim)的塊根中提取的一種蛋白質(zhì)，為我國(guó)傳統(tǒng)中藥"天花粉"的有效成分，它具有引產(chǎn)、抗腫瘤和抗HIV病毒等多種生物學(xué)功能。 TCS屬于單鏈核糖體失活蛋白(ribosomeinactivatingprotein，RIP)，以往的研究主要集中在結(jié)構(gòu)和藥理作用方面，對(duì)其引起細(xì)胞凋亡和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子機(jī)制研究得較少。為了更好地

2、進(jìn)行臨床應(yīng)用，有必要對(duì)天花粉蛋白的抗腫瘤作用機(jī)理進(jìn)行深入研究。 研究目的通過(guò)現(xiàn)代細(xì)胞和分子生物學(xué)的方法，深入研究TCS引起的腫瘤細(xì)胞凋亡和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程的規(guī)律，揭示其抗腫瘤作用的分子機(jī)理。 研究方法： 第一部分：天花粉蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡和周期阻滯的影響首先采用流式細(xì)胞術(shù)，以體外培養(yǎng)的鼠成纖維肉瘤細(xì)胞L929為對(duì)象，研究TCS對(duì)腫瘤細(xì)胞周期抑制作用；采用MTT法，在體外測(cè)定了TCS對(duì)Hela、Hep-G2、HCT11

3、6、Colo205等腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性。為了證實(shí)TCS引起細(xì)胞凋亡，利用Westernblot方法檢測(cè)了細(xì)胞凋亡過(guò)程中Caspase3和其它信號(hào)分子如PARP和JNK的激活情況，以本實(shí)驗(yàn)室表達(dá)的TCS的類(lèi)似蛋白PAP作為對(duì)照。 第二部分：天花粉蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞ERSTRESS作用研究為了研究TCS引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERStress)現(xiàn)象，首先采用Westernblot方法檢測(cè)了TCS引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白CHOP和BIP的表達(dá)，以

4、及CHOP誘導(dǎo)TRAIL受體蛋白DR5的上調(diào)情況；為了證明CHOP蛋白在TCS引起的細(xì)胞凋亡中的重要性，我們采用RNA干涉技術(shù)，將CHOPsiRNA轉(zhuǎn)染進(jìn)入L929細(xì)胞中以將CHOP基因knock-down，觀(guān)察轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞對(duì)TCS和TRAIL的敏感性的差異，用流式細(xì)胞術(shù)和MTT法測(cè)定TCS和TRAIL對(duì)上述兩種細(xì)胞的協(xié)同殺傷作用。 第三部分：AUTOPHAGY參與天花粉蛋白誘導(dǎo)的凋亡過(guò)程研究首先用Westernblot方法，檢

5、測(cè)了TCS誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的標(biāo)志蛋白LC3的轉(zhuǎn)化現(xiàn)象，再用雙熒光蛋白標(biāo)記的-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入細(xì)胞，并用激光共聚焦顯微鏡觀(guān)測(cè)了TCS處理下自噬體的形成現(xiàn)象，以本實(shí)驗(yàn)室表達(dá)的PAP作為對(duì)照；為了進(jìn)一步研究自噬在TCS誘導(dǎo)凋亡過(guò)程中的重要性，我們采用RNA干涉技術(shù)，通過(guò)siRNA轉(zhuǎn)染來(lái)分別knock-down與細(xì)胞自噬相關(guān)的基因Atg5、Atg7和Beclin，用Westernblot方法證實(shí)其表達(dá)水平；最后，用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定Atg5、Atg7

6、和Beclin基因knock-down細(xì)胞對(duì)用TCS和TRAIL處理的敏感性，來(lái)確定自噬過(guò)程對(duì)TCS引起的細(xì)胞凋亡的重要性。 研究結(jié)果： 第一部分：天花粉蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡和周期阻滯的影響L929細(xì)胞經(jīng)不同劑量TCS處理24h后，有明顯的G0/G1期阻滯，并呈時(shí)間和劑量的依賴(lài)性，而當(dāng)處理時(shí)間增加到48h后，高劑量組呈明顯的S期細(xì)胞周期阻滯。 MTT試驗(yàn)證實(shí)，TCS對(duì)各種腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)細(xì)胞毒性作用，各種腫瘤細(xì)胞對(duì)TC

7、S處理的敏感性不同。用Hoechst33342和SytoxGreen染色經(jīng)TCS處理的細(xì)胞可以在形態(tài)學(xué)上觀(guān)察到細(xì)胞凋亡。 TCS可以激活Caspase-3進(jìn)而引起凋亡，PARP是Caspase-3的作用底物，因此能觀(guān)察到PARP的的裂解，并呈時(shí)間和劑量依賴(lài)關(guān)系，對(duì)照蛋白PAP也有類(lèi)似的作用。當(dāng)培養(yǎng)基中加入泛Caspase抑制劑zVAD，可以完全阻斷高劑量TCS處理Hela細(xì)胞引起的PARP的裂解，除見(jiàn)到PARP的裂解外，還可以見(jiàn)

8、到Caspase-3酶原的激活和總JNK激酶的磷酸化激活。 第二部分：天花粉蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞ERSTRESS作用研究TCS可以引起L929細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，首先伴隨著分子伴侶BIP的逐漸升高，在24h小時(shí)后有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白CHOP的明顯表達(dá)，并觀(guān)察到TRAIL受體DR5表達(dá)水平升高，Caspase12酶原也是隨著時(shí)間逐漸地被激活。因?yàn)門(mén)CS可以上調(diào)DR5的表達(dá)，所以在TCS和TRAIL聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，呈現(xiàn)協(xié)同效應(yīng)。用siRNA轉(zhuǎn)染L

9、929細(xì)胞后，CHOP基因knock-down細(xì)胞表現(xiàn)為對(duì)TRAIL和TCS聯(lián)合處理的敏感性降低。 第三部分：AUTOPHAGY參與天花粉蛋白誘導(dǎo)的凋亡過(guò)程研究微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubuleassociatedprotein1lightchain3，LC3)，是在真核細(xì)胞發(fā)現(xiàn)的自噬標(biāo)志蛋白，Hela和L929細(xì)胞經(jīng)TCS處理3～6h，用Westernblot可以見(jiàn)到LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)化；采用熒光雙標(biāo)記的LC

10、3質(zhì)?？梢詸z測(cè)到TCS或PAP處理后Hela、HepG2和L929細(xì)胞有明顯的自噬體的形成現(xiàn)象。這些結(jié)果說(shuō)明TCS引起的細(xì)胞凋亡過(guò)程伴隨自噬的產(chǎn)生，PAP也有類(lèi)似的作用。 用MTT試驗(yàn)表明：溶酶體蛋白酶抑制劑氯喹可以協(xié)同TCS的細(xì)胞毒性，而自噬激活劑雷帕霉素可以拮抗TCS的細(xì)胞毒性。 用siRNA干擾自噬基因Atg5、Atg7和Beclin。結(jié)果表明Atg5和Beclin基因Knock-down細(xì)胞對(duì)TCS的敏感性顯著增

11、高，細(xì)胞毒性分別升高4.16和1.87倍，說(shuō)明自噬在TCS引起的凋亡過(guò)程中起到保護(hù)細(xì)胞的作用。 結(jié)論： (1)發(fā)現(xiàn)天花粉蛋白可以抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，其抗腫瘤作用是通過(guò)雙重機(jī)制即細(xì)胞周期阻滯和誘導(dǎo)凋亡來(lái)實(shí)現(xiàn)的； (2)天花粉蛋白可以引起明顯的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，可以誘導(dǎo)CHOP蛋白和BIP蛋白的表達(dá)； (3)天花粉蛋白可以通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，促進(jìn)TRAIL受體DR5的上調(diào)，增加腫瘤細(xì)胞對(duì)TRAIL的敏感性；