Tiam1對絨毛膜外滋養(yǎng)細胞遷移運動影響的研究.pdf

1、前言：
　　胎盤是胚胎發(fā)育成熟，妊娠順利完成的重要因素。而胎盤中滋養(yǎng)細胞是母體與胎兒直接接觸的部分，分為細胞滋養(yǎng)層細胞、合體滋養(yǎng)層細胞和絨毛膜外滋養(yǎng)層細胞。晚期囊胚著床后，絨毛膜外滋養(yǎng)細胞向子宮蛻膜層和肌層血管的進一步侵襲、遷移和分化是胎盤形成和母胎循環(huán)建立的關鍵，而且，絨毛膜外滋養(yǎng)層細胞適度的侵襲、遷移是正常妊娠所必須的。絨毛膜外滋養(yǎng)層細胞生物學功能過強會導致胎盤植入、葡萄胎及絨癌等疾病;功能過弱會導致子宮螺旋動脈重鑄不足，出現(xiàn)

2、流產(chǎn)、胎兒生長受限及子癇前期等病理產(chǎn)科。明確絨毛膜外滋養(yǎng)層細胞的侵襲和遷徙等的調節(jié)機制，是解決上述疾病的突破口和希望所在。
　　2007年Ferretti C等提出絨毛膜外滋養(yǎng)層細胞與腫瘤細胞在生物學性能方面存在著驚人的相似，包括高度的增殖能力，缺乏細胞間的接觸抑制，遷移入侵能力，可以逃脫免疫系統(tǒng)的能力等等。因此胎盤滋養(yǎng)細胞被定義為一種假惡性細胞，它的遷移和侵襲行為又被稱為“生理性轉移”。近年來，越來越多的腫瘤侵襲誘導或抑制基因應

3、用于滋養(yǎng)細胞的研究，例如nm-23、Kiss-1和RKIP等這些腫瘤轉移抑制基因在對滋養(yǎng)細胞的生物學行為有影響。
　　Tiam1(T lymphoma invasion and metastasis inducing factor 1)，全稱為T淋巴瘤侵襲轉移誘導因子1，最初是由荷蘭癌癥研究所Habets等發(fā)現(xiàn)并命名的。他們把隔離于逆轉錄病毒的侵襲性病毒變異株作為侵襲相關前病毒插入簇分析時發(fā)現(xiàn)一個單拷貝的不同于侵襲性細胞克隆BWM

4、LV-3.6的DNA片段，經(jīng)與基因庫對比及DNA印跡(Southen blot)分析，證實這是一個可影響侵襲力的基因，命名為Tiam 1基因。Tiam1屬于Rho三磷酸鳥嘌呤核苷酸水解酶(GTPases)家族。Tiam1則作為Rho蛋白家族重要成員Rac1的特異性鳥苷酸轉換因子(guanine nucleotide exchange factor，GEF)促進GDP的釋放以及與GTP的結合，它的GEF轉換功能與其蛋白的細胞膜轉位、氨基酸

5、殘基磷酸化有關。大量研究表明Tiam1基因在不同組織來源的腫瘤細胞中高表達，例如乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌、肝癌、直腸癌、甲狀腺癌、前列腺癌、膀胱癌和胰腺癌等。而在正常上皮組織中，Tiam1通過上調E-cadherin蛋白表達對上皮細胞的遷移具有抑制作用，在腎癌腫瘤細胞中通過調節(jié)TIMP1、TIMP9的表達抑制腫瘤細胞的遷移。
　　關于Tiam1是否在滋養(yǎng)細胞中有表達，是否對滋養(yǎng)細胞的侵襲、遷移具有調節(jié)作用至今還未見任何報道。本研究將

6、通過檢測不同侵襲、遷移能力的（早孕期和孕晚期）胎盤組織中Tiam1的表達量及表達部位;并檢測其對絨毛膜外滋養(yǎng)層細胞系HTR-8/svneo細胞遷移能力的變化，探討Tiam1與胎盤滋養(yǎng)細胞生物學功能改變的調節(jié)機制。
　　方法：
　　第一部分:應用實時定量RT-PCR法，免疫組織化學和Western blot進行Tiam1的定位及定量研究，明確Tiam1在以下兩種不同分組中的表達量是否有差異:
　　以妊娠周數(shù)作為分組條件，

7、留取妊娠7～9周的正常妊娠人工流產(chǎn)和妊娠38-40周的正常足月剖宮產(chǎn)胎盤絨毛組織。應用免疫組織化學法，觀察Tiam1在早孕胎盤絨毛及足月胎盤絨毛中的表達部位。應用RT-PCR和Western blotd分別比較Tiam1在mRNA和蛋白水平，在早孕組和足月組胎盤中的表達含量是否有差異。
　　第二部分:體外培養(yǎng)HTR-8/SVneo滋養(yǎng)細胞，脂質體2000介導瞬時轉染Tiam1高表達質粒和沉默Tiam1基因的siRNA進入絨毛膜外滋

8、養(yǎng)細胞HTR-8/SVneo細胞系。Transwell法觀察不同分組的HTR-8/SVneo細胞遷移能力的變化。
　　第三部分:檢測Tiam1高表達質粒和沉默Tiam1基因的siRNA轉染的HTR-8/SVneo細胞中β-catenin蛋白、E-cadherin及N-cadherin蛋白的表達差異，應用RT-PCR檢測不同組別的N-cadherin的mRNA表達量差異，探討Tiam1基因影響HTR-8/SVneo細胞遷移能力的作用

9、機制。
　　結果：
　　第一部分:我們利用quantitative real-time RT-PCR方法檢測Tiam1 mRNA在具有不同遷移及侵襲能力的胎盤中的表達量。發(fā)現(xiàn)Tiam1在mRNA水平上，在傾向于侵襲、遷移能力弱的足月組中表達量增高，而在傾向于侵襲、遷移能力強的早孕組中表達降低;足月組中Tiam1的mRNA水平的表達量是早孕組中的8倍。免疫組化發(fā)現(xiàn)，Tiam1蛋白在足月組胎盤中表達強于早孕組絨毛，差異有統(tǒng)計學意

10、義。進一步的Western blot結果提示，足月組胎盤中的Tiam1蛋白表達顯著高于早孕組絨毛的蛋白表達量，差異有統(tǒng)計學意義。這一結果提示Tiam1可能與胎盤滋養(yǎng)細胞的生物學行為有密切相關。
　　第二部分:瞬時轉染高表達的Tiam1質粒和沉默Tiam1的干擾RNA進入HTR-8/SVneo細胞系，HTR-8/SVneo細胞的轉染效率均達到了70-80％，最佳轉染時間為48小時。轉染入高表達的Tiam1質粒的HTR-8/SVneo

11、細胞中Tiam1蛋白的表達明顯上調，與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義;轉染入沉默Tiam1的干擾RNA的HTR-8/SVneo細胞中Tiam1蛋白的表達水平明顯下調，與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義（圖2-4）。Westernblot結果表明瞬時轉染高表達的Tiam1質粒的HTR-8/SVneo細胞中Tiam1的蛋白表達明顯增加了，而瞬時轉染沉默Tiam1基因的siRNA的HTR-8/SVneo細胞中Tiam1的蛋白表達則明顯下調。分別記錄在轉

12、染高表達Tiam1質粒和沉默Tiam1的siRNA后24小時、48小時和72小時，計數(shù)穿過Transwell小室的細胞數(shù)，轉染沉默Tiam1基因的siRNA后48小時的（si組）HTR-8/SVneo細胞遷移能力增強，而轉染高表達Tiam1質粒的（H組）HTR-8/SVneo細胞遷移能力降低，與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。提示Tiam1可以抑制HTR-8/SVneo細胞的遷移。
　　第三部分:瞬時轉染高表達的Tia

13、m1質粒和沉默Tiam1的干擾RNA的HTR-8/SVneo細胞，48小時后測定細胞中β-catenin蛋白、E-cadherin及N-cadherin蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)N-cadherin蛋白在Tiam1高表達組的HTR-8/SVneo細胞中的表達量是降低的，而siRNA組中的表達是明顯增加的，與對照組相比均有統(tǒng)計學意義。而β-catenin蛋白在各組中的表達無明顯差異。E-cadherin蛋白在HTR-8/SVneo細胞中未見表達。<